Gene expression study in the non-model organism Botryllus schlosseri through SOLiD RNA-seqs

Botryllus schlosseri è un ascidia coloniale diffusa in tutti i mari temperati del mondo. L’organismo è oggi ampiamente usato per lo studio, in prospettiva evolutiva, di un’ampia varietà di processi biologici che vanno dalla riproduzione sessuale e asessuale alla rigenerazione, all’alloriconosciemnto e alle risposte immunitarie. Tuttavia, nonostante la sua importanza come organismo modello, non è, a tutt’oggi, disponibile il genoma sequenziato. Abbiamo intrapreso uno studio del trascrittoma di B. schlosseri in diverse fasi di sviluppo coloniale e durante la rigenerazione della tunica. La riproduzione asessuale mediante gemmazione palleale e la rigenerazione del sistema vascolare sono stati i bersagli dei nostri esperimenti di RNA-seq. Nel primo esperimento, 3 diverse fasi del ciclo blastogenetico coloniale sono state prese in considerazione: il “mid-cycle”, quando le colonie sono molto attive metabolicamente; una fase immediatamente precedente il cambio di generazione (take-over), quando le colonie si stanno preparando al cambio di generazione, e la fase di “take-over”, quando gli zoidi adulti muoiono e vengono sostituiti dalle gemme che diventano funzionalmente mature. L’RNA totale è stato estratto da diverse colonie in ciascuna delle condizioni sperimentali considerate. Nel secondo esperimento, la tunica di alcune colonie è stata asportata marginalmente e lasciata rigenerare per 2 giorni. Dopo la rigenerazione, l’RNA totale è stato estratto. Librerie di cDNA sono state ottenute seguendo i protocolli SOLiD e sono state sequenziate usando sequenziatori SOLiD 4 e SOLID 5500. In mancanza di un genoma di riferimento è stato necessario produrre un assemblaggio del trascrittoma. In questa tesi viene descritto il primo metodo per assemblare dati di esperimenti RNA-seq adattato alla tecnologia di sequenziamento SOLiD. Le analisi condotte sui dati simulati hanno permesso di ottimizzare il metodo e minimizzare l'effetto delle isoforme di trascritti sulla qualità dell'assemblaggio. I dati di espressione e di annotazione genica sono stati archiviati in un database ad accesso rapido e gestiti in una struttura compatta direttamente accessibile tramite un'interfaccia Web. Attraverso l'uso di un comune Web browser, è possibile analizzare le diverse condizioni sperimentali e comparare i risultati ottenuti. I risultati hanno rivelato molte migliaia di trascritti differenzialmente espressi dei quali alcuni sono coinvolti nell'apoptosi naturale. Questo processo biologico è stato descritto a livello morfologico: durante il take-over, i tessuti degli zoidi vanno in apoptosi e questi ultimi sono sostituiti dalle gemme primarie che divengono il nuovo stadio adulto.