Basis of herbicide resistance in two troublesome summer weeds, Echinochloa crus-galli and Sorghum halepense

La resistenza agli erbicidi è un problema a livello mondiale e sta evolvendo velocemente anche in Italia, in particolare nelle zone dove monocoltura e scarsa rotazione di erbicidi con diverso meccanismo d’azione sono pratiche comuni. Inoltre, a causa dell’implementazione dei regolamenti a livello Europeo e dell’ampio utilizzo di gruppi di erbicidi con sito d’azione altamente specifico, sta diminuendo il numero di principi attivi a disposizione, aumentando così il rischio di insorgenza di nuovi casi di resistenza e rendendo più difficoltosa la loro gestione. La linea guida principale del mio progetto è lo studio multidisciplinare della resistenza agli erbicidi in infestanti poliploidi di colture estive, allo scopo di ottenere informazioni utili per un uso più responsabile degli erbicidi e nuove indicazioni per la gestione della resistenza. In particolare sono state caratterizzate due delle malerbe più problematiche nelle colture estive: Echinochloa crus-galli (L.) Beauv., infestante di mais e riso in Nord Italia, e Sorghum halepense (L.) Pers., infestante di colture dicotiledoni in Italia e di mais in Ungheria. Entrambe le specie hanno sviluppato resistenza a due classi di erbicidi selettivi: gli inibitori dell’acetil coenzima A carbossilasi (ACCasi) e quelli dell’acetolattato sintasi (ALS). Gli scopi di questo lavoro sono molteplici, a livello pratico in quanto queste due specie stanno diventando un grosso problema nella gestione delle colture infestate e a livello scientifico poiché, vista la difficoltà di lavorarci, sono stati fatti pochi studi su specie poliploidi. Il progetto è stato sviluppato nel corso dei tre anni, a partire dallo screening delle popolazioni presunte resistenti di ogni specie e la determinazione del pattern e dei livelli di resistenza attraverso degli esperimenti di dose-risposta. I risultati mettono in evidenza come la resistenza agli inibitori dell’ALS in E. crus-galli si stia diffondendo rapidamente: sono state confermate diverse popolazioni resistenti agli inibitori dell’ALS (tredici campionate in mais e nove in riso) e, per la prima volta in Europa, dei casi di multi-resistenza agli inibitori dell’ALS e dell’ACCasi (cinque in colture di riso). La situazione del S. halepense in Italia è abbastanza stabilizzata (le cinque popolazioni resistenti agli inibitori dell’ACCasi trovate in colture dicotiledoni risalgono al 2007), mentre la resistenza alle solfoniluree (una famiglia degli inibitori dell’ALS) si sta diffondendo rapidamente in alcune regioni dell’Ungheria, dove dieci popolazioni sono state confermate negli ultimi tre anni. Gli indici di resistenza calcolati per gli inibitori dell’ALS sono risultati molto elevati per tutte le popolazioni, indicando che potrebbe essere coinvolto un meccanismo di tipo target-site. Successivamente sono stati condotti esperimenti diversi per le due specie. Per quel che riguarda E. crus-galli lo studio si è concentrato sulle basi molecolari e fisiologiche della resistenza agli inibitori dell’ALS, attraverso una serie di esperimenti in vitro. Il Southern blotting ha chiaramente dimostrato la presenza di copie multiple del gene ALS nel genoma di E. crus-galli. Il saggio enzimatico che misura l’attività dell’ALS ha dato alti livelli di resistenza per entrambi gli inibitori dell’ALS testati, confermando che un sito target alterato è responsabile della resistenza a questo gruppo di erbicidi. Un lavoro lungo e difficile, a causa della natura poliploide della specie e della scarsità di informazioni in letteratura, ha permesso di ottenere per la prima volta la sequenza del gene ALS di E. crus-galli, che è stata pubblicata nel database GenBank. Su questa sequenza sono stati costruiti primers specifici e, attraverso degli esperimenti di clonaggio, sono state analizzate due o tre piante per ogni popolazione, per arrivare infine alla costruzione di alberi filogenetici utilizzando le sequenze dei cloni. Questa procedura ha permesso di identificare due clusters che sono stati associati a due copie espresse del gene ALS (ALS1 e ALS2). La mutazione forte Trp-574-Leu, una tra le mutazioni più documentate che inducono resistenza agli inibitori dell’ALS in diverse specie, è stata trovata in tutte le piante resistenti, e sempre nella copia del gene ALS1. E’ stato poi costruito e validato un marcatore molecolare, chiamato AS-CAPS (Allele Specific - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) per l’identificazione della mutazione 574, in omozigosi o in eterozigosi, in un ampio numero di campioni. Per quel che riguarda S. halepense, geofita che si riproduce anche per seme, sono state eseguite delle analisi di crescita con lo scopo di studiare l’allocazione della biomassa nei due organi riproduttivi di diversi biotipi (suscettibili, resistenti agli inibitori dell’ACCasi e resistenti agli inibitori dell’ALS). Inoltre, sono state parzialmente studiate le basi molecolari della resistenza dei due diversi gruppi di erbicidi. Analisi molecolari precedenti hanno confermato che in tutte le popolazioni resistenti agli inibitori dell’ACCasi incluse nell’esperimento era presente la mutazione Ile-2041-Asn. L'analisi dei campioni con il marcatore molecolare Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 2041 ha confermato la presenza di questa variante allelica in tutte le piante delle popolazioni resistenti. I tre esperimenti di analisi di crescita hanno indicato che la resistenza è associata a diversi pattern di allocazione della biomassa, almeno per quel che riguarda le popolazioni resistenti agli ACCasi che hanno la variante allelica Ile-2041-Asn: il biotipo resistente ha una produzione minore di pannocchie, e allo stesso tempo di semi, e una maggior percentuale di biomassa allocata sotto terra, dovuta alla maggior produzione di rizomi. Non sono state invece osservate chiare differenze fra il biotipo resistente agli inibitori dell’ALS e quello suscettibile, probabilmente a causa del diverso tipo di resistenza coinvolto: infatti sono state trovate due diverse mutazioni, la Trp-574-Leu in una popolazione e la Asp-376-Glu in un’altra. I risultati si sono dimostrati coerenti quando è stato utilizzato lo stesso materiale di partenza. In particolare, gli esperimenti del 2009 e del 2011, dove sono state utilizzate piante cresciute da rizoma, hanno dato risultati molto simili. Invece alcune differenze sono state registrate nell’esperimento del 2010, dove le piante utilizzate sono cresciute da seme. I risultati mostrano come la situazione di E. crus-galli in coltivazioni di riso sia particolarmente preoccupante, a causa della scarsità di erbicidi efficaci con diversi modi d’azione. Quindi è molto importante prevenire almeno l’evoluzione di biotipi multi-resistenti. Questo può essere ottenuto solamente attraverso l’implementazione delle strategie di gestione della resistenza basate su un reale approccio di gestione integrata delle malerbe.