Isolation and characterisation of mouse amniotic fluid stem cells: study of their origin, regenerative potential and reprogramming into pluripotent cells

Introduzione: Le cellule staminali hanno la capacità di dare orgine ad una progenie di cellule mature mantendo la capacità di autorinnovamento. Possono essere distinte sulla base delle loro potenzialità in totipotenti, pluripotenti, multipotenti, oligopotenti e unipotenti. Possono anche essere distinte in cellule staminali embrionali, fetali e adulte. Le cellule staminali embrionali, ottenute dalla massa cellulare interna della blastocisti, sono pluripotenti. Nell'embrione le cellule primordiali germinali danno origine ai gameti, ed esprimono i marcatori di pluripotenza (Oct4, Nanog, Sox2), ma non sono pluripotenti. Esse possono essere riprogrammate in vitro, diventando così cellule germinali embrionali. Tra le cellule staminali fetali ci sono le cellule staminali del liquido amniotico (AFS). Queste cellule sono isolate dal liquido amniotico per la positività al marcatore c-kit e sono presenti sia nell'uomo che nel topo, anche se la loro origine embrionale non è nota. Le cellule AFS umane sono multipotenti in vitro; le cellule AFS umane e murine hanno uno specifico potenziale ematopoietico, in vivo e in vitro. Recentemente è stato dimostrato che le cellule AFS umane ottenute dal primo e dal secondo trimestre di gravidanza, possono essere riprogrammate in vitro in cellule pluripotenti, a seguito dell'aggiunta di acido valproico. Inoltre, le cellule del liquido amniotico sono state anche utilizzate da diversi gruppi di ricerca per ottenere cellule staminali indotte alla pluripotenza (iPS). Per questi motivi, le AFS rappresentano una sorgente innovativa di cellule per approcci di medicina rigenerativa. L'atrofia spinale muscolare (SMA) è una malattia autosomica recessiva, causata della delezione o mutazione omozigote del gene della sopravvivvenza del motoneurone 1 (SMN1). Il trapianto di midollo osseo in un modello murino di SMA attenua il fenotipo miopatico, tuttavia non lo recupera totalmente e non mostra alcun effetto benefico a lungo termine. Scopo della tesi: Gli scopi di questa tesi consistono nella caratterizazzione delle cellule murine AFS isolate a fresco, nella valutaione del loro potenziale miogenico dopo il trapianto in animali HSA-Cre, SmnF7/F7, nello studio della loro origine embrionale e nell'induzione alla pluripotenza usando un metodo non virale (PiggyBac, PB). Materiali e Metodi: Le cellule murine AFS sono state ottenute attraverso amniocentesi e successiva immunoselezione per il marcatore c-kit mediante biglie magnetiche. Le cellule AFS sono state analizzate per l'espressione di diversi marcatori (CD90, CD45, CD44, CD34, CD31, Flk1, Sca1, CD105) attraverso la citometria a flusso e per l'espressione di Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog e Sca-1, attraverso qRT-PCR , a diversi stadi embrionali. Sono stati valutati il potenziale ematopoietico in vitro e la capacità di formare teratomi in topi Rag2-/-γc-/-. Per la riprogrammazione a cellule embrionali germinali, le cellule AFS sono state seminate su feeder layer di STO o Sl4-m220, mitoticamente inattivato, con il terreno per le cellule primordiali germinali, supplementato con LIF e il fattore per la crescita dei fibroblasti (bFGF) e successivamente con il terreno N2B27 2iLIF. Per il trattamento dei topi HSA-Cre, SmnF7/F7 le cellule AFS isolate da topi GFP+, sia isolate a fresco che coltivate, sono state iniettate nelle vena della coda e i topi sono stati sacrificati un mese dopo trapianto ed i muscoli analizzati mediante ematossilina ed eosina, tricromica di Masson e con immunofluorescenza per l'espressione di distrofina/GFP. Per studiare l'origine embrionale delle cellule AFS sono stati utilizzati due modelli murini: Oct4-GFP e TNAP-Cre. Per l'induzione alla pluripotenza, cellule ottenute dai feti Oct4-GFP son state trasfettate con i plasmidi del trasposone PB-TET contenente quattro geni (Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4) sotto il controllo trascrizionale del promotore inducibile tetO2 tetraciclina/doxiciclina. L'espressione dei geni della pluripotenta è stata indotta con la doxiciclina. Le cellule iPS così ottenute sono state testate per l'espressione dei marcatori Nanog, SSEA-1 e per la positività alla fosfatasi alcalina. Risultati: Le cellule AFS c-kit+ murine variano in numero durante il corso della gestazione. Queste cellule esprimono i marcatori ematopoietici (CD45, CD34, Sca1), mesenchimali (CD90, CD105) insieme a Flk1, CD31, CD44. Sulla base dell'epressione di c-kit sono state identificate due popolazione cellulari: c-kithigh e c-kitlow, che mostrano anche una differente espressione dei marcatori sopracitati. Le cellule c-kitlow sono presenti in numero maggiore e durante il corso della gestazione diminuiscono mentre le c-kithigh aumentano. Entrambe le popolazioni hanno un potenziale ematopoieitco in vitro. Le cellule murine AFS esprimono a bassi livelli i geni Oct4 e Sox2 e ad alti livelli c-Myc e Klf4, ma la loro espressione cambia durante il corso della gestazione. La stessa analisi eseguita a livello di singola cellula ha mostrato che allo stadio E13.5 il 5% delle cellule co-esprime Oct4, Sox2 e Klf4. Le cellule AFS murine non formano teratoma. Negli esperimenti di terapia cellulare topi HSA-Cre, SmnF7/F7 non trattati, morivano all'età di 10 mesi mentre topi trattati con le cellule AFS o cellule da midollo osseo non frazionato avevano una sopravvivvenza del 75% e del 50%, rispettivamente. I topi trattati con le cellule AFS, mostravano un recuperano della forza muscolare rispetto agli animali non trattati (+75%). I muscoli degli animali trattati con le cellule AFS mostravano una morfologia normale con un numero basso di fibre rigeneranti (<1%) e una normale espressione delle distrofina che per il 37.86% (± 9.48%) era GFP+. A 15 mesi dal trattamento, gli animali trattati con cellule del midollo osseo avevano un maggior numero di fibre centro nucleate e una consistente infiltrazione di tessuto interstiziale e nessuna fibra GFP+. Gli animali trattati con le cellule AFS mostravano un fenotipo migliore e il 58.00% (± 2.43%) delle fibre muscolari era GFP+. Risultati simili sono stati ottenuti trattando topi HSA-Cre, SmnF7/F7 con cellule AFS espanse in vitro. Per cercare di differenziare le cellule AFS in cellule embrionali germinali pluripotenti abbiamo testato due protocolli ma nessuna colonia che ricordasse cellule embrionali germinali si è formata in vitro. Le cellule AFS isolate dai feti Oct4-GFP erano GFP negative. Il modello TNAP-Cre è risultato essere aspecifico, perchè TNAP non risultava essere espresso solo nelle cellule germinali primordiali. Negli esperimenti di riprogrammazione, alcuni cloni di iPS hanno mostrato di essere doxiciclina indipendenti, esprimevano il gene Oct4 endogeno ed erano positivi per i marcatori Nanog e SSEA1 e per la fosfatasi alcalina. Discussione: Le cellule murine AFS sono una popolazione eterogenea, le cui caratteristiche variano durante il corso della gestazione ed esprimono marcatori ematopoietici, mesenchimali e anche marcatori tipici delle cellule endoteliali. Il potenziale differenziativo delle due popolazioni c-kithigh e c-kitlow dovrà essere testato in vivo. L'analisi dell'espressione genica a livello di popolazione e a livello di singola cellula per i marcatori della pluripotenza ha confermato l'eterogeneità delle cellule AFS. Il trattamento degli animali HSA-Cre, SmnF7/F7 ha mostrato un potenziale miogenico delle cellule murine AFS, anche a lungo termine, suggerendo un interessante potenziale terapeutico. Le cellule AFS potrebbero contribuire a generare nuove fibre muscolari fondendosi con fibre esistenti o integrarsi nelle nicchia delle cellule staminali muscolari, ma maggiori esperimenti saranno necessari per valutare la validità dell'ipotesi. Anche le cellue AFS coltivate hanno dimostrato il mantenimento delle proprietà rigenerative. Questo studio suggerisce che le cellule AFS murine probabilmente non derivano da cellule primordiali germinali. Tuttavia è importante ricordare che il modello murino Oct4-GFP non è un modello di lineage tracking. Maggiori esperimenti saranno necessari per confermare questi risultati e per identificare l'origine delle cellule AFS. Le cellule iPS sono un promettente strumento di ricerca come modello di malattia o nella speranza di ottenere una sorgente di cellule per terapia. Qui è stato dimostrato come il sistema del PB può essere un valido metodo per la riprogrammazione delle cellule murine AFS. Questi sono solo risultati preliminari e maggiori esperimenti saranno necessari per completarne la caratterizzazione.