Development of microfluidic cell culture technology for the study of type 2 diabetes

Il Diabete Mellito di Tipo 2 (T2DM) è una patologia molto complessa provocata da una disfunzione a livello omeostatico che ha come conseguenza l’alterazione del normale consumo di glucosio da parte delle cellule e, conseguentemente, una elevata concentrazione di glucosio nel sangue. La complessità della malattia comporta l’utilizzo di molti farmaci che agiscono con diversi meccanismi e modi, e con effetti che spesso sono differenti tra pazienti. Il numero di persone nel mondo con T2DM diagnosticato è sempre più elevato e con esso l’impatto sul costo dell’assistenza sanitaria. Al giorno d’oggi una cura definita per questa patologia non esiste. I modelli animali sono tra i sistemi più usati nello studio della patologia e per valutare l’effetto di nuovi farmaci in fase preclinica. Anche se validi, ed essendo tuttora i più usati, questi modelli mostrano numerose limitazioni. Gli studi in vivo su uomo sono possibili ma molto costosi; richiedono inoltre un enorme contributo in termini di provvedimenti etici e di sicurezza. Molto spesso non si riesce ad ottenere una valutazione a livello di singolo tessuto con la conseguente difficoltà di una corretta interpretazione dei risultati. Per tutte queste ragioni è elevato l‘interesse nello sviluppare modelli in vitro alternativi che facilitino da un lato lo studio della patologia e dall’altro la ricerca farmacologica. Obiettivo di questa tesi è di sviluppare un modello in vitro rappresentativo della fisiologia di tessuti umani in grado di simulare la fisiopatologia del Diabete Mellito di Tipo 2. In particolare, questa tesi riporta la progettazione e lo sviluppo di una tecnologia microfluidica applicata allo studio dell’insulino-resistenza e del consumo di glucosio in colture cellulari e tessuti umani in vitro. Attraverso l’impiego di tecnologie microfluidiche, applicate a tecniche di misurazione del glucosio, è stato possibile misurare con elevata risoluzione temporale il consumo di glucosio in modo completamente non invasivo. La tecnologia è stata applicata al muscolo scheletrico e al tessuto adiposo, ottenendo elevato grado di riproducibilità degli esperimenti e sensibilità nelle misure. Durante questa tesi alcuni prototipi di piattaforma microfluidica sono stati sviluppati e prodotti attraverso tecniche di soft litografia multistrato. Il dispositivo è in grado di integrare al suo interno sia colture cellulari 2D che di tessuto 3D ex vivo, mantenendole metabolicamente attive e vitali per diversi giorni. La capacità di coltura a lungo termine ottenuta ha permesso elevata flessibilità degli esperimenti. Il dispositivo è stato dotato di microcomponenti integrati per il controllo e la movimentazione di liquidi. Microvalvole e micropompe integrate permettono un elevato grado di automazione della piattaforma, con possibilità di controllo off chip tramite software. Tali sistemi di controllo hanno permesso lo sviluppo di sistemi di iniezione per un elevato controllo spazio temporale di sostanze biochimiche, come ad esempio insulina o altri farmaci antidiabetici. Il consumo di glucosio è stato valutato attraverso misure ad alta risoluzione del medium di coltura post camera attraverso tecniche analitiche di misura su nanolitri di campioni, generando profili temporali di concentrazione di glucosio con risoluzione di decine di minuti. È stata misurata la concentrazione di glucosio intracellulare attraverso nano sensori FRET. L’accoppiamento di queste due tecniche ha permesso una valutazione innovativa del consumo di glucosio e attività cellulare. I risultati ottenuti rivelano buone potenzialità per future sperimentazioni farmaceutiche e cliniche. Lo sviluppo di tecnologie microfluidiche integrate a colture ex vivo derivate da pazienti può dare buoni risultati nello sviluppo di terapie paziente specifiche.