Star-like guanidyl-oligosaccharidic polymer as a new nanoplatform for sirna delivery towards cancer cells

La terapia genica viene definita come il trattamento o la prevenzione di malattie umane attraverso l’introduzione all’interno di cellule specifiche di nuovo materiale genetico quali gli oligonucleotidi terapeutici (siRNA, miRNA etc.)1. Negli ultimi decenni, molti ricercatori hanno investito nello sviluppo in sistemi di delivery di oligonucleotidi terapeutici (ONs). Tuttavia, la somministrazione di ONs risulta difficile e si osserva una bassa biodisponibilità ed efficacia biologica data la loro natura anionica, l’elevato peso molecolare e le fragilità strutturali. Queste macromolecole, subiscono una rapida degradazione da parte delle nucleasi del siero, possiedono un trascurabile trasporto transmembrana, possono accumularsi in maniera aspecifica e stimolare il sistema immunitario2. Nanocarrier cationici (ad esempio polimeri e lipidi) rappresentano una delle più promettenti strategie per proteggere e trasportare ONs all’interno di cellule malate. In questo lavoro, è stato disegnato un nuovo un nuovo polimero cationico per la complessazione di siRNA basata su interazioni di tipo colombiano (attrazione di carica). Partendo da un oligosaccaride (il maltotriosio) una molecola dalla struttura a stella è stata sintetizzata (Agm6-M-COOH) tramite un protocollo multi-step utilizzando una polimerizzazione a trasferimento atomico radicale (ATRP). A questa molecola è stata quindi coniugata una catena di glicole polietilenico (PEG) al fine di aumentare la biocompatibilità del sistema (Agm6-M-PEG). I complessi, che normalmente vengono chiamati “poliplessi”, sono stati preparati per auto assemblaggio tra il polimero cationico e ONs. I poliplessi hanno dimostrato migliorare i parametri farmacocinetici e farmacodinamici degli ON generando un interessante modello per la terapia antitumorale. I saggi elettroforetici sono stati impiegati per valutare la formazione dei poliplessi a diversi rapporti azoto/fosforo (N/P ratio) partendo da 0.5 fino a 5. La completa complessazione del siRNA è stata ottenuta a valori di N/P ratio pari a 3. Le interazioni termodinamiche tra il polimero cationico e ONs sono state esplorate attraverso la calorimetria a titolazione isotermica (Isothermal Titration Calorimetry, ITC). I poliplessi sono stati caratterizzati tramite Dynamic Light Scattering (DLS) mostrando un dimensione media nel range di 50-75 nm e una carica superficiale in un intervallo di valori da -5 mV a +11 mV in funzione del rapporto N/P. Un basso indice di polidispersione è stato osservato, confermando che le formulazioni sono monodisperse. I poliplessi aventi 3 e 5 N/P ratio hanno mostrato possedere le migliori caratteristiche fisico-chimiche e sono stati ulteriormente caratterizzati e testati in vitro. Le analisi morfologiche delle formulazioni sono state effettuate attraverso la microscopia elettronica a trasmissione. Da tale analisi si è osservato che le particelle possiedono una struttura a bastoncello. I poliplessi inoltre hanno evidenziato la capacità di proteggere siRNA dalle nucleasi e una buona stabilità in siero. La forza dell’interazione tra il polimero e il siRNA e la stabilità dei poliplessi è stata ulteriormente confermata via elettroforesi attraverso il test di spiazzamento con eparina. Infatti, il totale spiazzamento di siRNA dal complesso avviene solo a concentrazioni di eparina pari a 2.5 IU/mL, circa 16 volte superiori rispetto a quelle presenti nel torrente ematico (0.15 IU/mL). Studi preliminari in vitro sono stati effettuati su cellule MCF-7 di adenocarcinoma mammario umano, cellule KB di carcinoma della cervice uterina umana e cellule MC3T3-E1 di fibroblasti di embrioni murini e hanno mostrato una buona biocompatibilità e uptake cellulare. Inoltre, è stato osservato come la differente composizione e struttura dei poliplessi influenzi l’uptake cellulare: i poliplessi con un aspect ratio più piccolo sono internalizzati più efficientemente rispetto ai poliplessi che presentano un aspect ratio maggiore. L’attività emolitica dei poliplessi è stata presa in considerazione misurando l’effetto dei poliplessi sui globuli rossi del sangue. Dai test efettuati è emerso un trascurabile effetto emolitico per entrambe le formulazioni in analisi. Al fine di aumentare la sito-selettività del sistema, i poliplessi sono stati successivamente formulati al fine di essere direzionati contro cellule tumorali. Per questa ragione, il polimero cationico è stato funzionalizzato alla fine della catena con acido folico (Agm6-M-PEG-FA). L’attività di silencing dei poliplessi decorati con diverse quantità di acido folico è stata valutata utilizzando siRac1. Dallo studio è emerso che i poliplessi costituiti con il 25% w/w di Agm6-M-PEG-FA sono risultati i più efficienti nella riduzione dell’espressione di Rac1. In questo contesto, uno studio comparativo tra poliplessi aventi 25%w/w di polimero derivatizzato con acido folico e poliplessi senza acido folico è stato intrapreso. Al fine di individuare il miglior modello in vitro e in vivo, è stato fatto uno screening di diverse linee cellulari per valutare l’espressione del recettore dell’acido folico e le cellule MDA-MB-231 di adenocarcinoma mammario sono state selezionate come quelle a maggior espressione. Studi di silenziamento e tossicità da parte dei poliplessi sono stati effettuati. Per questo motivo, siRac1 è stato utilizzato come siRNA terapeutico per le sue capacità di inibire la migrazione cellulare, la formazione di metastasi e l’invasione cellulare3. I poliplessi con e senza acido folico hanno mostrato un’elevata biocompatibilità (maggiore dell’80% per tutte le concentrazioni testate con il saggio MTT) e una elevata immuno-compatibilità (valutata attraverso stimolazione del sistema immunitario). I poliplessi direzionati con acido folico hanno mostrato un miglior gene silencing di circa due volte superiore rispetto ai poliplessi non direzionati (86% e 53% rispettivamente). L’abilità dei poliplessi di inibire la migrazione cellulare è stata osservata attraverso il saggio di wound healing. La chiusura del “taglio” è stata osservata dopo 12 ore e i risultati hanno mostrato un’inibizione del 40% della migrazione cellulare dopo trattamento con una dose equivalente di siRNA pari a 500 nM di poliplessi decorati con acido folico. Al contrario, poliplessi non decorati inibiscono la migrazione solo del 15%. Nonostante la differente attività di silencing e di inibizione della migrazione cellulare, non sono state osservate differenze di internalizzazione tra i poliplessi con e senza acido folico con analisi confocale e Imagestream. Pertanto, studi di traffiking intracellulare sono stati eseguiti. Poliplessi portanti acido folico sono stati osservati nel citoplasma e nessuna co-localizzazione con endosomi e lisosomi è stata osservata. Al contrario, poliplessi non portanti acido folico sono stati visualizzati all’interno di entrambi i compartimenti cellulari. I meccanismi di internalizzazione cellulare sono stati valutati attraverso la marcatura di caveolin-1 e di clathrin heavy chain attraverso anticorpi. L’internalizzazione caveolae-mediata è stata osservata per i poliplessi con acido folico mentre per i poliplessi senza acido folico un meccanismo di endocitosi mediato da clatrine è stato osservato. Questi risultati evidenziano un coinvolgimento dell’acido folico nel processo di uptake mediato da caveolae che è stato visto incrementare l’attività di silenziamento genico. La tossicità sistemica dei poliplessi con e senza acido folico è stata studiata su femmine di topo Nu/Nu usando dosi equivalenti di siRNA nell’intervallo di 1-6 mg/kg. L’obiettivo di questo test è di raggiungere la massima dose tollerata attraverso una crescente somministrazione di siRNA. Tuttavia nessuna tossicità è stata ottenuta per entrambe le formulazioni. Infine, è stato studiato in vivo l’accumulo dei poliplessi con acido folico. Da questo studio si è osservato un accumulo di Rac1 rispetto alla soluzione salina o a un siRNA non codificante (siEGFP) di circa 500 e 65 volte rispettivamente. Inoltre è stato possibile individuare una correlazione tra le dimensioni del tumore e l’accumulo dei poliplessi. Studi istologici hanno confermato l’accumulo dei poliplessi nel tessunto tumorale.