Studio dell' attività biologica della proteina ORF-A del virus dell' immunodeficienza felina

Il Virus dell' Immunodeficienza Felina (FIV) è un Lentivirus dei non primati che causa nel gatto domestico una sindrome cronica progressiva molto simile alla Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS) generata dal Virus dell' Immunodeficienza Umana di tipo 1 (HIV-1). Le analogie tra FIV ed HIV-1 coinvolgono numerosi aspetti, tra cui l' organizzazione genomica, il ciclo replicativo, i bersagli cellulari ed i meccanismi patogenetici. Per questi motivi FIV ed il suo ospite naturale rappresentano un interessante modello per la ricerca sull'AIDS. Similmente ad HIV-1, il genoma di FIV contiene i geni gag, pol, env che codificano le proteine strutturali ed enzimatiche del virione e i geni accessori e regolatori che giocano un ruolo chiave nella regolazione e nell' infettività virale. A differenza del genoma di HIV-1 caratterizzato dalla presenza di quattro geni accessori, il genoma di FIV ne presenta due: vif ed orf-A. Di questi, il primo codifica il fattore di infettività virale, molto simile a quello di HIV-1, mentre il secondo gene codifica la proteina Orf-A. Il ruolo biologico di Orf-A non è stato ancora chiarito, ma si ritiene rappresenti una proteina accessoria multifunzionale con caratteristiche simili alle proteine accessorie di HIV-1 quali Vpr, Tat e Nef. Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio, volto a chiarire la biologia di base di FIV, focalizzandosi sulle funzioni svolte dalla proteina Orf-A. Inizialmente è stata valutata l' espressione della proteina ed il suo coinvolgimento nel ciclo cellulare mediante diversi sistemi di over-espressione. Successivamente sono stati condotti gli stessi esperimenti in un contesto più simile a quello fisiologico. Pertanto, sono stati ottenuti plasmidi basati sul genoma provirale, Orf-A plus e minus, dove l' estremità Carbossi-terminale della proteina Orf-A è stata fusa al tag HA. I vettori sono stati testati sia in cellule umane che feline per valutarne l' espressione ed il coinvolgimento nella progressione del ciclo cellulare. Gli stessi plasmidi sono stati impiegati per valutare i) la localizzazione della proteina Orf-A e della Ciclina B1 target del blocco del ciclo cellulare in saggi di immunofluorescenza; ii) la capacità replicativa del virus; iii) l' incorporazione della proteina Orf-A nelle particelle virali. Nel complesso, i risultati suggeriscono che, laddove la proteina Orf-A è espressa, si verifica un arresto del ciclo cellulare in fase G2/M indicando un ruolo di Orf-A simile a quello descritto per la proteina Vpr di HIV-1. Inoltre, per la prima volta in letteratura, è stata dimostrata l' incorporazione della proteina Orf-A nelle particelle virali. Questo studio contribuisce a dissezionare le funzioni della proteina Orf-A di FIV ed a chiarire i meccanismi alla base della biologia del Virus dell' Immunodeficienza Felina e, più in generale, di quella dei lentivirus