Nefrocalcinosi e placche di Randall: un processo di biomineralizzazione a livello renale? Studio cellulare e molecolare di un processo di calcificazione spontanea di cellule papillari in vitro

La patogenesi della calcolosi renale ossalico-calcica è oggetto di discussione. Le placche di Randall originano nella membrana basale dell’ansa di Henle e agiscono come siti di ancoraggio per la formazione di calcoli. La presenza di idrossiapatite (chimicamente simile alla componente minerale dell’osso) in queste strutture potrebbe deporre per un processo di biomineralizzazione attiva. Studi sulle calcificazioni vascolari hanno dimostrato che cellule di origine mesenchimale (periciti, cellule vascolari calcificanti, cellule vascolari muscolari lisce) possono differenziare in cellule con fenotipo osteoblastico, con conseguente sintesi di proteine tipiche dell’osteoide (osteopontina, osteocalcina, osteonectina) in un processo di biomineralizzazione simile all’osteogenesi. Con queste premesse si ipotizza che cellule della papilla possano differenziare verso la linea osteogenica, determinando la sintesi di proteine tipiche dell’osso e mineralizzazione in apatite del tessuto renale. Questo fenomeno potrebbe aver luogo in patologie renali associate a nefrocalcinosi, come il rene con midollare a spugna (MSK). Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha trovato che in alcuni pazienti con nefrolitiasi e MSK bilaterale sono presenti mutazioni del gene GDNF (glial derived neurotrophic factor), che potrebbero essere correlate con la malattia. Da biopsia chirurgica da polo indenne per carcinoma renale in una paziente con MSK e portatrice di una mutazione in eterozigosi di GDNF sono state allestite colture primarie di cellule papillari renali. L’analisi della biopsia renale ha evidenziato nefrocalcinosi papillare e una piccola placca di fosfato di calcio. Abbiamo osservato la crescita spontanea in vitro delle cellule fino al passaggio p4, notando nelle cellule la capacità di organizzarsi in noduli, a partire dal passaggio p2, con una modalità simile a quella descritta per i periciti calcificanti. E’ stata condotta un’analisi immunocitochimica (ICH) per tipizzare i vari tipi cellulari con marcatori per cellule endoteliali (von Willebrand), cellule muscolari lisce (?SMA), cellule epiteliali (citocheratina, E-caderina, ZO-1), cellule mesenchimali (vimentina e desmina) e periciti (3G5). L’analisi ha evidenziato eterogeneità cellulare al p1 e, a partire dal p2, la comparsa di un fenotipo mesenchimale. La presenza di depositi di fosfato di calcio nelle cellule e/o nei noduli è stata rivelata mediante colorazione con il reagente di Von Kossa e analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM); il saggio della fosfatasi alcalina ha evidenziato alcune cellule positive nelle vicinanze dei noduli. Lo studio ICH dei marcatori osteogenici ha rivelato una positività per osteocalcina e osteonectina e una negatività per osteopontina nelle cellule e nei noduli. Questi risultati sono stati confermati attraverso studi di RT PCR nei quali i livelli di espressione di osteonectina e di Cbfa1 (fattore trascrizionale regolatore dell’espressione dei geni osteogenici) aumentavano a partire dal p1 fino al p4, in parallelo allo sviluppo dei noduli; al contrario i livelli di osteopontina diminuivano durante gli stessi passaggi. Lo studio dei livelli di espressione di GDNF nelle cellule MSK ha mostrato una down-regolazione del gene, suggerendo un suo possibile coinvolgimento nel fenomeno osservato. Sono state allestite come controllo colture primarie di cellule renali papillari provenienti da un soggetto di sesso ed età comparabili, senza MSK né nefrolitiasi. Le cellule al passaggio p3 sono state incubate con glicerolfosfato e dexametazone per la possibile induzione di un fenotipo osteogenico ma non hanno presentato crescita nodulare né spontanea né indotta. I dati raccolti depongono un processo attivo e spontaneo di calcificazione nelle cellule MSK in coltura, suggerendo che nella papilla renale sono presenti cellule in grado di differenziare verso la linea osteoblastica. Se questo processo sia dovuto al transdifferenziamento di cellule renali residenti o al differenziamento di progenitori renali verso il lineaggio osteogenico non è ancora noto e dovrà essere approfondito. La presenza della mutazione di GDNF potrebbe svolgere un ruolo nella differenziazione osteogenica, conferendo alle cellule un’immaturità che potrebbe renderle maggiormente suscettibili ad un possibile fenomeno di transdifferenziamento. I nostri risultati suggeriscono un nuovo meccanismo patogenetico per la nefrocalcinosi in MSK e probabilmente anche in altre nefrolitiasi.