The role of small non-coding RNAs in human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection and transformation

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è l’agente eziologico della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL, Adult T-cell leukemia/lymphoma), un’aggressiva neoplasia a carico dei linfociti T CD4+ maturi, e della paraparesi spastica tropicale/mielopatia associata ad HTLV (TSP/HAM, Tropical spastic paraparesis/HTLV-associated myelopathy), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. L’interesse crescente nello studio e nella comprensione della funzione degli “small non-coding RNA” in cellule normali e tumorali ci ha spinto ad uno studio del loro ruolo nell’ attivazione e nella trasformazione delle cellule T. Il lavoro descritto nella presente tesi mira a comprendere il ruolo degli “small non-coding RNA” (sncRNA), in particolare microRNA e frammenti tRNA (tRFs), nell’ infezione da HTLV-1 e nella patogenesi dell’ATLL. Nel nostro laboratorio sono state generate librerie di “small RNA” per identificare il repertorio di sncRNA espressi in due linee cellulari infettate con HTLV-1 (C91PL e MT-2) rispetto alle cellule T CD4 + normali. I risultati hanno rivelato un’aumentata espressione del miR-34a nelle linee cellulari infettate. Molti frammenti di tRNA (tRFs) sono stati identificati sia nelle cellule infettate che non infettate. Uno dei tRFs più abbondanti (tRF-3019) è derivato dall’ estremità 3’ del tRNA-prolina, che è considerato il primer per la trascrittasi inversa dell’HTLV-1. I risultati ottenuti da un saggio di trascrittasi inversa in vitro hanno dimostrato che il tRF-3019 è in grado di funzionare da primer nella trascrizione inversa di HTLV-1. La presenza sia del tRNA-prolina che del tRF-3019 è stata evidenziata nelle particelle virali. Il tRF-3019 potrebbe quindi svolgere un ruolo importante nella retrotrascrizione del virus e potrebbe rappresentare un “target” terapeutico nell’infezione da HTLV-1. I dati ottenuti dall’ analisi con microarray sull’ espressione di microRNA in campioni di ATLL e in campioni di cellule T-CD4 + normali ha rivelato una diminuzione nell’espressione di 21 microRNA e un’aumentata espressione di 6 microRNA. I microRNA sovraespressi comprendono anche il miR-34a, che è un membro della famiglia dei miR-34, altamente conservati, che agiscono come oncosoppressori indotti da p53 in diversi tipi cellulari. Tuttavia, p53 è inattiva o mutata in cellule ATLL e in linee cellulari HTLV-1-infettate. Il trattamento di linee cellulari infettate con Nutlin-3a, un farmaco che ripristina l'attività di p53 legandosi a MDM2, ha rivelato un aumeto di espressione di miR-34a e una forte riduzione dell’espressione di alcuni dei suoi target. Questi risultati suggeriscono che attivando il pathway di p53 in cellule HTLV-1-infettate si potrebbe promuovere l’ingaggio del network regolatorio del miR-34a. Infine, ci siamo proposti di identificare i microRNA regolati dalla proteina virale Tax. A tal fine la linea cellulare T non infetta, Jurkat, è stata transfettata con un plasmide di espressione per Tax e sono state testate le variazioni di espressione di mRNA e microRNA mediante RT-PCR. I risultati hanno rivelato che in presenza di Tax ci sono alterazioni significative nei livelli di espressione di 7 microRNA. Queste variazioni includono il microRNA let-7g, i cui livelli sono ridotti nelle cellule che esprimono Tax. Da studi effettuati su microrrays, let-7g risulta sottoespresso in campioni ATLL rispetto alle cellule CD4 normali, suggerendo che questo microRNA potrebbe svolgere un ruolo di oncosoppressore nella trasformazione mediata da HTLV-1. Gli esperimenti, attualmente in corso, permetteranno di identificare i target di let-7g in cellule infettate utilizzando come punto di partenza 14 geni ottenuti dall’integrazione dei risultati dei programmi di predizione dei target dei microRNA con i profili di espressione di microRNA e mRNA in cellule ATLL rispetto ai controlli CD4.