Monitoring motions in relevant biological systems by means of Electron Paramagnetic Resonance

Molto spesso modelli biochimici in sistemi viventi sono basati su eventi meccanici, i quali sono il risultato di moti di grande ampiezza a cui sono soggette diverse proteine in seguito a stimoli chimici. Nel corso dell'esplicazione delle loro funzioni, infatti, queste proteine vanno incontro a variazioni conformazionali anche importanti, che ne regolano il comportamento finale. Un punto chiave per la comprensione della funzione di tali sistemi, pertanto, risulta essere una conoscenza più profonda degli stessi e dei meccanismi che regolano i loro moti. Il particolare, il lavoro contenuto all'interno di questa tesi è focalizzato allo studio di due sistemi biologici rilevanti: l'indagine su sistemi motore, come la classe della miosina di tipo II, coinvolta nella contrazione muscolare, e la ricerca riguardante una proteina di maturazione coinvolta nel corretto assemblaggio del sito attivo di una [FeFe]-idrogenasi. La miosina è uno dei tre motori molecolari che risultano essere presenti nel genoma delle cellule eucariotiche e, insieme all'actina, è responsabile della contrazione muscolare. Nel corso dell'esplicamento della sua funzione, la miosina va incontro a variazioni conformazionali che si traducono in una variazione del suo stato biochimico, provocando il motore biologico necessario alla contrazione. Mutazioni puntuali e modifiche post-traduzionali della miosina portano come conseguenza a disfunzioni contrattili e l'organismo può andare incontro a serie patologie e gravi danni. Finora, il corretto e l'alterato funzionamento della miosina sono stati principalmente studiati dal punto di vista di variazioni legate all'attività di idrolisi dell'ATP o al risultato meccanico, senza prestare particolare attenzione al dettaglio molecolare in relazione ad alterazioni strutturali della proteina. Lo studio della meccanica della miosina ad un livello molecolare, combinata all'indagine di parametri meccanici come produzione di forza e velocità di accorciamento delle fibre, risulta pertanto necessario in sistemi alterati per una progettazione oculata di farmaci per la cura di tali disfunzioni. Tale obiettivo, infatti, risulterebbe pressochè impossibile da raggiungere in assenza di una più profonda conoscenza delle alterazioni a livello strutturale della proteina coinvolta nel globale funzionamento del sistema. Le [FeFe]-idrogenasi sono enzimi che catalizzano la produzione reversibile di idrogeno in molti batteri ed eucarioti unicellulari, e numerosi sforzi vengono attualmente spesi per comprendere come il complesso sito attivo (denominato cluster H) sia assemblato. Il sito è caratterizzato dalla presenza di un cluster [4Fe4S]-2Fe la cui biosintesi richiede la cooperazione di tre proteine di maturazione conservate: HydFE, HydF e HydG. Tra queste, HydF ha un ruolo centrale nell'intero processo di maturazione, possiede infatti un doppio ruolo di scaffold per l'assemblaggio del sito attivo e di trasportatore del gruppo prostetico maturo all'idrogenasi vera e propria, che viene così convertita nella forma attiva. La proteina contiene un dominio per il legame del nucleotide GTP; le variazioni conformazionali di questo dominio, in relazione alla funzione espletata dalla proteina, devono ancora essere chiarite a livello molecolare, ma sono certamente responsabili dell'interazione tra le diverse proteine coinvolte nel processo di maturazione. Tale studio ha guadagnato un notevole interesse scientifico nel corso degli ultimi anni, poichè la bioproduzione di idrogeno è considerata una fonte pulita di energia, limitata tuttavia dagli alti costi di produzione. Per tali ragioni, una conoscenza più approfondita riguardo l'assemblaggio ed il funzionamento del sito catalitico è richiesta al fine di migliorare la capacità di produzione di idrogeno. La tecnica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR), accoppiata a marcatura sito-specifica con sonde paramagnetiche, risulta essere la tecnica principe per quanto riguarda l'indagine delle variazioni conformazionali in entrambi i sistemi, dal momento che queste sonde sono sensibili alla dinamica rotazionale ed interna in molecole di interesse biologico. In particolare, EPR in onda continua permette di ottenere informazioni circa la dinamica di un nitrossido in un sito di interesse, oltre che informazioni sull'accessibilità dello stesso al solvente, mentre la tecnica DEER può essere utilizzata per misurare distanze tra coppie di spin. In questo modo, eventuali variazioni conformazionali indotte da diversi stimoli nei sistemi studiati possono essere studiate e si possono avanzare proposte riguardo un modello di funzionalità di queste proteine. In questa tesi, le diverse tecniche EPR sono state applicate in modo da gettare luce sulle variazioni a livello molecolare che avvengono in questi sistemi in seguito all'applicazione di diversi stimoli o mutazioni. Per avere una visione più generale sugli eventi che avvengono in queste proteine, le indagini sono state affiancate da test di funzionalità biochimica. Per quanto concerne lo studio sulla miosina, come risultato principale abbiamo ottimizzato un set-up per l'indagine spettroscopica di fibre muscolari, che ci ha permesso di approfondire lo studio di sistemi alterati; in particolare, lo studio si è concentrato su ipertrofia, atrofia ed ossidazione nei muscoli di topo. Nel caso di HydF, invece, si è svolta un'indagine dettagliata delle variazioni strutturali causate dal legame del GTP alla proteina. I risultati mostrano in modo inequivocabile che la maturasi in questione si comporta come altre proteine denominate GTP switches, le quali subiscono importanti variazioni conformazionali, fondamentali per la loro funzionalità, in seguito al legame del nucleotide. Il lavoro presentato in questa tesi è stato diviso in tre parti: nella prima parte, verranno date un'introduzione generale sull'importanza di moti molecolari che avvengono in sistemi biologici ed una panoramica sulle tecniche EPR utilizzate nello studio; nelle altre due parti, invece, verranno discussi i risultati ottenuti per i due sistemi che sono stati oggetto del presente lavoro.