The role of CpsABCD in Streptococcus agalactiae capsule biosynthesis

Streptococcus agalactiae, anche detto streptococco gruppo B (GBS), è un batterio Gram-positivo comunemente identificato come colonizzatore asintomatico del tratto gastrointestinale e urogenitale nel 15-35% delle donne. Durante il parto, GBS può essere trasmesso dalla madre colonizzata al neonato, il quale può sviluppare sepsi, polmoniti o meningiti. La diffusione di screening e trattamenti profilattici pre-parto ha significativamente ridotto l’incidenza delle malattie neonatali causate da GBS. Negli Stati Uniti, ad esempio, l’incidenza media di queste infezioni è dello 0.04%. Nel mondo occidentale, tuttavia, S. agalactiae rappresenta ancora la prima causa di meningiti batteriche nei neonati e la metà degli infetti soffre di difetti nello sviluppo neurologico a lungo termine. Patologie causate da GBS sono riscontrate anche in altri tipi di pazienti, quali gli anziani, le donne gravide, i diabetici e gli immunodepressi. Alcuni vaccini contro GBS sono attualmente in fase di sviluppo e sono basati sul polisaccarde capsulare (CPS) di S. agalactiae. Il CPS è il maggior fattore di virulenza di GBS ed è in grado di inibire la deposizione del complemento sulla superficie del patogeno e l’opsonofagocitosi. La presenza di una capsula polisaccaridica che riveste la superficie batterica è una caratteristica comune a molti batteri e il pathway Wzy e uno dei tipici meccanismi usati per produrre i polisaccaridi che compongono questa struttura. Questo processo è stato descritto in dettaglio per S. pneumoniae. La produzione del CPS inizia all’interno della cellula con la sintesi delle unità saccaridiche da parte di una serie di glicosiltrasferasi. Successivamente le unità sono trasferite sul lato esterno della membrana batterica dove una polimerasi incorpora le unità ripetute al polisaccaride nascente. Il polisaccaride viene infine attaccato al peptidoglicano della parete cellulare e crea lo strato della capsula. Tutti i geni che codificano gli enzimi responsabili di questo processo si trovano in un unico operone. Lo scopo di questa tesi è di investigare il ruolo delle proteine CpsABCD codificate dall’operone cps. Queste proteine sono conservate in tutti i sierotipi di GBS e in altri batteri, ma non sono direttamente coinvolte nella biosintesi delle unità saccaridiche che compongono il CPS. In letteratura, CpsA è descritto come un regolatore trascrizionale o un enzima che attacca il CPS alla parete cellulare. Le proteine omologhe di CpsBCD di S. pneumoniae compongono un sistema di fosforegolazione la cui funzione nell’ambito della biosintesi del CPS non è stata chiarita. Per studiare il ruolo di CpsABCD in GBS abbiamo sviluppato dodici mutanti in cui i geni cpsABCD sono stati deleti o mutati. Per ognuno di questi mutanti sono stati caratterizzati la quantità, la dimensione e la localizzazione cellulare del CPS prodotto, e lo stato di fosforilazione di CpsD. Inoltre mediante l’uso del bacterial two hybrid assay sono state analizzate le interazioni tra alcune di queste proteine. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, anche in GBS, CpsB, C e D compongono un sistema di fosforegolazione in cui CpsD è l’autochinasi e CpsB è la fosfatasi. CpsD fosforila le tirosine che si trovano al suo C-terminale e la sua attività è dipendente dalla presenza della coda C-terminale di CpsC. Le tirosine di CpsD sono a loro volta defosforilate da CpsB. La trascrizione dell’operone cps è stata analizzata mediante qRT-PCR in tutti i mutanti e i risultati hanno mostrato che le proteine CpsABCD non sono coinvolte nella regolazione trascrizionale dell’operone. Inoltre, l’osservazione che i mutanti mantengono la capacità di produrre il CPS, conferma che queste proteine non partecipano alla sintesi del polisaccaride. Tuttavia, per alcuni mutanti sono state osservate differenze nella lunghezza del CPS e nella sua localizzazione. I dati ottenuti suggeriscono che il dominio extracellulare di CpsC è necessario per la produzione di polisaccaridi ad alto peso molecolare e il dominio LytR di CpsA è responsabile del trasferimento del CPS alla parete cellulare. Infine, lo studio delle interazioni tra proteine ha dimostrato che CpsC interagisce con CpsD e CpsA. Queste evidenze sperimentali hanno permesso di suggerire delle possibili funzioni per CpsABCD. Queste proteine sono principalmente coinvolte nella regolazione dei due processi che terminano la biosintesi del CPS: la polimerizzazione e il trasferimento del polisaccaride alla parete cellulare. Nel modello che proponiamo, l’elongazione del CPS da parte della polimerasi viene interrotta dall’azione di CpsA che trasferisce il polisaccaride neosintetizzato alla parete cellulare. L’azione di CpsA viene modulata dallo stato di fosforilazione del complesso CpsCD che è quindi responsabile del bilanciamento dei due processi di elongazione e trasferimento del CPS alla parete cellulare. Infine, abbiamo studiato l’impatto delle differenze fenotipiche del CPS sulla capacità di GBS di interagire con le cellule umane. A questo scopo è stato impiegato un saggio di adesione-invasione in vitro usando cellule epiteliali polmonari e alcuni dei mutanti sviluppati. I risultati ottenuti hanno mostrato che i mutanti aventi un CPS di lunghezza diversa dal ceppo wild type presentano difetti di adesione alle cellule. Inoltre i ceppi privi di CPS o aventi una bassa quantità di CPS sono in grado di invadere le cellule più efficacemente, indipendentemente dalla lunghezza del polisaccaride prodotto.