NITRATE SENSING BY MAIZE ROOTS: A KEY ROLE FOR NITRIC OXIDE SIGNALING IN THE TRANSITION ZONE

L’attuale modello di produzione agricola di tipo intensivo ha permesso di sfamare negli ultimi cinquanta anni una popolazione mondiale cresciuta in maniera esponenziale, ma, allo stesso tempo, è stato anche la causa dell’insorgere di preoccupanti problemi a livello ambientale, sia a scala locale che globale. Molti di questi problemi sono dovuti all’uso massiccio di fertilizzanti azotati di sintesi che derivano dal processo industriale Haber-Bosch. Mediamente più del 50% dell’azoto fornito come fertilizzante non è assorbito dalle colture, causando una catena di effetti negativi a livello ambientale che hanno come target finale la salute dell’uomo. Il mais (Zea mays L.) rappresenta già una delle principali colture agrarie e varie stime attribuiscono a questo cereale un ruolo alimentare fondamentale anche nei prossimi decenni, quando la popolazione mondiale dovrebbe assestarsi, secondo le proiezioni, tra i 9.2 e gli undici miliardi di abitanti. Parallelamente al raggiungimento dell’obiettivo della sicurezza alimentare, l’agricoltura è chiamata a produrre rese crescenti in maniera sempre più sostenibile a livello ambientale. Punto centrale per la ricerca in agricoltura, il miglioramento dell’efficienza di utilizzo dell’azoto (in inglese NUE, Nitrogen Use Efficiency) da parte delle colture agrarie, per garantire produzioni crescenti senza ulteriore accumulo di forme reattive dell’azoto nell’ambiente. Per questo motivo, la comprensione dei meccanismi molecolari e fisiologici che regolano l’adattamento dell’apparato radicale delle colture agrarie alle fluttuazioni delle concentrazioni di azoto nel terreno, rappresenta un obiettivo primario nell’ottica di un progressivo utilizzo di nuove tecnologie finalizzate ad una agricoltura più sostenibile. Il corretto sviluppo fisiologico di una coltura agraria non dipende, infatti, solo dalla disponibilità di azoto nel terreno, ma anche dall’efficienza d’intercettazione del nutriente da parte dell’apparato radicale. Le piante generalmente sono in grado di assimilare sia nitrato che ammonio tuttavia, nei suoli agrari ben aerati, la principale fonte di azoto è rappresentata dal nitrato. Negli ultimi anni numerosi lavori hanno evidenziato un ruolo del nitrato come molecola segnale, considerato che moltissimi geni coinvolti nei processi di sviluppo e di crescita della pianta sono regolati da questo anione. Tuttavia molti di questi aspetti rimangono ancora da decifrare nel loro insieme. Anche l’ossido nitrico (NO) si sta ritagliando negli ultimi anni un ruolo sempre più importante nell’ambito dello studio delle risposte delle piante agli stress. Tuttavia, il suo esatto ruolo in risposta agli stress nutrizionali è stato solo abbozzato. In questo lavoro è stata studiata in dettaglio la produzione di ossido nitrico che si registra nelle radici di mais in presenza di nitrato, concentrandosi inizialmente sullo studio della regolazione dei geni coinvolti nell’omeostasi dell’ossido nitrico. In un secondo momento è stato anche preso in esame il ruolo dell’ossido nitrico come attore chiave nel modulare differenti risposte morfologiche a livello radicale in presenza di nitrato. Per meglio discriminare eventuali effetti specifici delle varie forme di azoto a livello transcrittomico, l’espressione di un numero di geni in precedenza identificati per essere regolati dall’azoto è stata analizzata in condizioni di disponibilità/carenza sia di nitrato che ammonio. In particolare, il profilo trascrizionale di cinque geni, che specificamente esprimono (i) una nitrato reduttasi citosolica (NR1), (ii) due differenti isoforme di emoglobine di tipo non simbiotico (nsHbs), (iii) una nitrito reduttasi (NiR) e, infine, (iv) un trasportatore ad alta-affinità del nitrato (NRT2.1), ha evidenziato una risposta esclusiva al nitrato. Questi geni non hanno manifestano, infatti, variazioni significative nei livelli di espressione quando è stata utilizzato come unica fonte azotata l’ammonio. Questo primo screening è stato altresì importante perchè ha permesso di focalizzarsi nelle analisi successive solamente su quei geni che rispondono specificatamente al nitrato; gli stessi che hanno dimostrato poi, durante l’avanzamento della ricerca, essere anche quelli attivamente coinvolti nel controllo dell’omeostasi dell’ossido nitrico, e cioè la nitrato reduttasi e l’emoglobina. Questi primi risultati ci hanno permesso quindi di ipotizzare un modello di regolazione molecolare che vede coinvolti questi geni in un’azione coordinata responsabile della sintesi (NR) e rapida inattivazione (nsHb) dell’ossido nitrico, in quanto molecola estremamente reattiva e tossica per la cellula, in risposta al nitrato. In aggiunta, una serie di analisi morfologiche sulla radice elaborate grazie all’aiuto di uno specifico software (WinRhizo) ha evidenziato come il nitrato agisca anche in maniera specifica e differenziale sullo sviluppo dell’apparato radicale (sono stati presi in esame come indici radicali: (i) la lunghezza totale, (ii) la superficie totale, (iii) il diametro medio delle radici e (iv) il numero di apici laterali). L’ipotesi che l’ossido nitrico sia prodotto nelle radici in risposta al nitrato è stata vagliata successivamente per mezzo di una serie di misurazioni in vivo dell’ossido nitrico, usando come sonda specifica per l’ossido nitrico il composto DAF-2DA e misurando poi la fluorescenza (indice della presenza di ossido nitrico) negli apici radicali sia allo stereo microscopio che al microscopio confocale. I risultati ottenuti hanno confermato pienamente la teoria che suggerisce come l’ossido nitrico sia specificatamente sintetizzato dall’attività della nitrato reduttasi in presenza di elevate concentrazioni di nitrato. Le osservazioni al microscopio hanno inoltre evidenziato come la fluorescenza, indice della presenza dell’ossido nitrico, fosse massima e concentrata in una specifica area dell’apice radicale, e cioè la zona di transizione, situata tra l’apice meristematico e la zona di allungamento. Infatti successivamente, grazie all’utilizzo di un inibitore dell’attività dell’enzima nitrato reduttasi (tungstato) e del composto cPTIO (uno scavenger dell’ossido nitrico), l’ipotesi di partenza che prevede la sintesi dell’ossido nitrico legata all’attività della nitrato reduttasi in risposta al nitrato, e la rapida inattivazione da parte dell’emoglobina, è stata dimostrata e ulteriormente confermata anche dall’utilizzo di queste sostante in analisi di espressione genica, supportando pienamente l’ipotesi di una azione concertata di questi geni finalizzata alla regolazione omeostatica della sintesi/scavenging dell’ossido nitrico in risposta al nitrato. Una nuova serie di analisi è stata in seguito condotta nell’ottica di meglio caratterizzare eventuali differenze nei livelli di espressione di questi geni nelle diverse zone che compongono l’apice radicale. A questo proposito, l’espressione dei geni NR1, NiR e le due nsHbs, in risposta al nitrato, è stata analizzata specificatamente in quattro diverse zone della radice: (i) il meristema, (ii) la zona di transizione, (iii) la zona di allungamento e infine (iv) la zona di maturazione. In radici allevate in assenza di nitrato, il livello massimo di accumulo di trascritto per tutti i geni considerati si è concentrato nel meristema. In risposta al nitrato però, la zona di transizione ha registrato invece l’accumulo maggiore. In base a questi ultimi dati e allo studio della letteratura, suggeriamo l’ipotesi che il nitrato agisca nell’attivazione di una via di segnalazione che ha come risultato finale una risposta differenziale a livello morfologico della radice, per meglio rispondere alla presenza dell’anione nel terreno, e di come la percezione e l’attivazione di questa via di signaling avvenga specificatamente nella zona di transizione. Questa ipotesi non deve stupire, considerando la crescente mole di lavori che attribuisce a questa piccolissima zona dell’apice radicale un ruolo fondamentale nella percezione degli stimoli (sia interni sia esterni) e nella immediata traduzione in risposte adattive all’ambiente. Partendo da queste osservazioni, le analisi successive sono state focalizzate quindi allo studio degli effetti specifici che il nitrato esercita sulla regolazione della crescita della radice primaria, fenomeno che prende avvio a livello cellulare immediatamente a monte della zona di transizione e che gioca un ruolo cruciale nell’adattamento delle radici ai cambiamenti della disponibilità del nutriente nel suolo. L’analisi condotta ha evidenziato un effetto di stimolazione del nitrato nella crescita ma soprattutto ha confermato una probabile partecipazione dell’ossido nitrico in questo processo di induzione all’allungamento, considerando che l’aggiunta di cPTIO ad una soluzione nutritiva ricca di nitrato riduce la crescita. Parallelamente, l’aggiunta di un donatore di ossido nitrico (SNP) in una soluzione nutritiva questa volta priva di nitrato ha evidenziato coerentemente un effetto di stimolazione alla crescita. L’utilizzo di tungstato infine, che si è manifestato in un forte effetto di inibizione all’allungamento in plantule allevate in presenza della fonte di azoto, suggerisce ulteriolmente un ruolo chiave della nitrato riduttasi nella produzione di ossido nitrico in risposta al nitrato, e di come questo meccanismo di fine-tuning omeostatico abbia degli effetti a livello fenotipico. Per riassumere, questi dati collettivamente presi indicano come nella radice di mais esista una via di segnalazione in risposta al nitrato mediato dall’attività dell’ossido nitrico, in concerto con la regolazione omeostica garantita dall’azione condivisa della nitrato reduttasi e dell’emoglobina. Tuttavia nuove analisi si rendono necessarie per caratterizzare meglio questa via di signaling e scoprire nuovi attori che partecipano a valle della sintesi di NO in risposta al nitrato, e che intervengono infine nel modulare differenzialmente la morfologia della radice. A questo riguardo, molti studi suggeriscono di concentrare la ricerca sugli effetti dell’ossido nitrico a livello di modificazioni del citoscheletro, così come sulle interconnessioni tra l’ossido nitrico e l’ormone vegetale auxina. Partendo da queste ultime considerazioni, la parte finale del mio progetto di dottorato è stata finalizzata allo studio degli effetti che il nitrato esplica, specificatamente nella zona di transizione, sulla formazione della parete cellulare (un processo cellulare mediato dall’attività del citoscheletro) e delle emicellulose in particolare (xiloglucani). Inoltre, un’analisi preliminare è stata anche condotta per verificare gli effetti del nitrato sul trasporto polare dell’auxina. I risultati fin qui ottenuti dall’analisi immunochimica, suggeriscono come il nitrato abbia un effetto significativo nella regolazione del trafficking vescicolare degli xiloglucani nella zona di transizione. Infatti, questi costituenti di parete dai nostri primi dati, mostrano un più elevato tasso di sintesi o recycling in risposta all’anione. L’utilizzo dell’inibitore specifico del trafficking vescicolare Brefeldin A (BFA), ha confermato ulteriormente questa ipotesi. Questa ipotesi assegna al nitrato un ruolo di stimolazione del recycling vescicolare degli xiloglucani. Coerentemente con i dati precedenti che hanno mostrato un effetto di induzione del nitrato nella crescita della radice, un più elevato trafficking di materiale di parete può essere interpretato come un’azione per permettere alle pareti cellulari di distendersi maggiormente e di assecondare un più rapido sviluppo necessario per l’allungamento evocato dal nitrato. Infine, è stato visualizzato anche un effetto del nitrato riguardante il trasporto polare delle auxine mediato dai trasportatori PIN1 nella zona di transizione. In presenza di nitrato infatti, l’auxina si localizza preferibilmente a livello di cross-walls (end-poles), e questo effetto è specificatamente indotto dal nitrato. Questo dato è stato supportato anche dalle osservazioni sull’immunolocalizzazione dei trasportatori PIN1, che hanno mostrato di co-localizzare in risposta al nitrato negli stessi siti di accumulo (end-poles) precedentementi osservati per l’auxina. Nuove analisi sono necessarie per meglio inquadrare il ruolo giocato dall’ossido nitrico all’interno in questi processi cellulari, considerando le numerose interconnessioni che legano NO, auxina e citoscheletro nella regolazione delle risposte adattative della radice all’ambiente esterno.