Design and development of a polimeric tubular scaffold for peripheral nerve regeneration

RIASSUNTO Le lesioni nervose periferiche costituiscono un problema clinico piuttosto comune, il quale inficia in modo significativo la qualità della vita dei pazienti. In caso di lesioni gravi con perdita di sostanza, al fine di colmare il gap tra il moncone prossimale ed il distale, il gold- standard prevede l’impianto di innesti nervosi autologhi utilizzando nervi sensoriali (ad es., nervo surale o nervo cutaneo antibrachiale). Tuttavia, criticità quali la morbidità del sito donatore, la perdita in funzionalità, la mancata corrispondenza dimensionale tra il nervo donatore ed il nervo lesionato oltre ad uno scarso recupero funzionale hanno spinto l'interesse verso l'identificazione di un approccio alternativo. Allo stato dell’arte, chirurghi e ricercatori stanno volgendo la loro attenzione verso innesti polimerici diversi (grafts) di natura sia biologica che artificiale. Infatti, lo sviluppo di neuroguide capaci di: a) creare un microambiente ideale per la rigenerazione assonale; b) fornire una protezione dall'infiltrazione di tessuto circostante; c) possedere un’efficacia analoga a quella garantita dall’innesto nervoso autologo; costituirebbe un vantaggio significativo nell’ambito della chirurgia del nervo periferico. Nel corso degli anni, sono stati studiati molti biomateriali di origine sia naturale che sintetica aventi caratteristiche differenti in termini di biodegradabilità. Tuttavia, considerando la qualità del tessuto rigenerato, non è ancora stata individuata una protesi più performante rispetto alle altre. L’obiettivo di questo studio è stato quello di allestire e studiare, sia in vitro che in vivo, le caratteristiche ed il potenziale rigenerativo di tre diverse neuroguide rispettivamente costituite da: alcool polivinilico (PVA); PVA ossidato 1% (PVA Ox 1%) e Fibroina della Seta (FS). Mentre l’impiego di PVA e FS per la realizzazione di grafts è già stato investigato in passato, il PVA Ox 1% (recentemente brevettato dal nostro gruppo di ricerca) costituisce un nuovo materiale per questo scopo. In parallelo, questo studio ha anche consentito di confrontare la qualità della rigenerazione assonale sostenuta da neuroguide diverse sia per origine (sintetica vs naturale) che per proprietà biodegradative (biodegradabili vs nonbiodegradabili).
Dopo aver allestito le tre diverse soluzioni polimeriche, sono stati quindi preparati scaffolds sia discoidali che in forma di graft tubulare, utilizzati rispettivamente per i successivi studi in vitro e in vivo. Nell’ambito degli studi in vitro, è stata effettuata una caratterizzazione morfologica dei supporti mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Successivamente, la biocompatibilità e l'attività biologica dei tre differenti scaffolds è stata valutata utilizzando una linea di cellule di Schwann (SH-SY5Y). Le cellule sono state seminate sui supporti e la loro adesione e la proliferazione è stata valutata mediante saggio MTT oltre che SEM a due differenti end-point (3 e 7 giorni dalla semina). Per quanto riguarda lo studio in vivo, i graft tubulari sono stati impiantati in modelli animali (ratti Sprague- Dawley) di lesione nervosa periferica con perdita di sostanza (gap tra moncone prossimale e distale: 5 mm). A 12 settimane dalla chirurgia, è stato valutato il recupero funzionale del nervo sciatico; successivamente, gli animali sono stati sacrificati. Dopo dissezione, prima di procedere all’espianto, l'aspetto macroscopico degli innesti è stato attentamente osservato in situ. I campioni sono stati quindi prelevati e trattati per le successive analisi istologiche (ematossilina ed eosina) ed immunoistochimiche (anti-CD3; anti-S100) nonché per ulteriori analisi di microscopia elettronica a scansione (TEM). L'obiettivo è stato quello di valutare la qualità del tessuto rigenerato evidenziando eventuali differenze di efficacia tra i tre tipi di grafts; a tal fine, anche l'analisi istomorfologica si è rivelata fondamentale, permettendo essa di quantificare gli assoni (mielinici vs amielinici) in diverse porzioni del campione (porzione prossimale vs centrale vs distale). Il nervo sciatico controlaterale è stato usato come controllo. Considerando i risultati degli studi in vitro, le immagini al SEM hanno mostrato come i supporti in PVA e FS mostrino una superficie liscia e regolare; al contrario, una certa ruvidità è stata notata osservando l’ultrastruttura degli scaffold discoidali in PVA Ox 1%. Nonostante il diverso aspetto ultrastrutturale dei supporti, esso non sembra influenzare l'interazione con le cellule. Il PVA (sia nativo che ossidato) non sostiene l'adesione e la proliferazione cellulare; infatti, sia le analisi al SEM che il saggio MTT non hanno identificato la presenza di cellule SH-SY5Y dopo 3 e 7 giorni dalla semina. Questo risultato può essere attribuito alla elevata idrofilia degli idrogeli Al contrario, gli scaffold in FS sono adeguati per promuovere la crescita delle SH-SY5Y. Per quanto riguarda lo studio in vivo, tutti i graft mostrato buone caratteristiche in termini di manipolabilità, essendo facilmente suturabili e dimostrando anche una adeguata resistenza allo strappo; gli scaffold in PVA appaiono più flessibile rispetto alle guide in FS. Dopo 12 settimane dalla chirurgia, tutti gli animali hanno mostrato un certo recupero funzionale dell’arto operato; in particolare, tutti distribuivano il proprio peso corporeo anche sulla zampa posteriore. Pur non zoppicando, gli animali impiantati con PVA e SF mostravano talvolta degli spasmi durante la deambulazione, al contrario, gli animali impiantati con graft in PVA Ox 1% esibivano un movimento normale. Al momento della dissezione, i tre graft erano ancora chiaramente identificabili. Non è stata riscontrata alcuna dislocazione degli innesti o formazione di neuroma in corrispondenza dei monconi; inoltre, la trasparenza delle tre neuroguide ha permesso di identificare la presenza di un tessuto rigenerato al loro interno. Successivamente, sono state effettuate analisi istologiche ed immunoistochimiche per valutare la qualità della rigenerazione assonale. Preliminarmente, mediante colorazione con ematossilina ed eosina (sezione trasversale della porzione centrale) è stato possibile mettere in evidenza l'integrità morfologica della struttura. Procedendo dalla periferia della sezione verso l'interno sono riconoscibili: una capsula fibrosa esterna; il graft; ed il tessuto neo-rigenerato, omogeneo e denso, nel mezzo. La biocompatibilità degli innesti è stata verificata mediante analisi immunoistochimica; la scarsa presenza di cellule CD3+ ha dimostrato l'assenza di reazioni infiammatorie gravi riconducibili all’impianto. Contestualmente, l’elevata presenza di elementi S100+ riscontrata in tutti i campioni ha comprovato una evidente rigenerazione assonale. In parallelo, la morfologia tipica del tessuto nervoso periferico è stata altresì evidenziata mediante colorazione con Blu di Toluidina mediante la quale è stato considerato anche l'aspetto dei monconi prossimale e distale.
Sebbene tutti i campioni supportino il recupero della lesione, alcune differenze possono essere riscontrate tra i tre gruppi sperimentali; questi risultati sono stati confermati anche dalle micrografie al TEM. L'analisi morfometrica dei campioni ha valutato il numero totale di assoni/nervo e la loro densità (assoni / μm2); per ogni innesto sono state considerate le sezioni prossimale, centrale e distale. I dati raccolti hanno dimostrato che il PVA Ox 1% assicura un risultato migliore nella rigenerazione assonale rispetto agli innesti non biodegradabili in PVA, il quale tra i tre gruppi è risultato essere quello con l’outcome inferiore. I risultati di questo studio hanno mostrato che, in caso di neurotmesi con perdita di sostanza, tutti i graft allestiti (PVA; PVA Ox 1% e FS) promuovono la rigenerazione del nervo. Considerando la qualità del tessuto rigenerato, sono stati osservati dei risultati migliori con graft in PVA Ox 1% rispetto a quelli ottenuti da neuroguide in PVA e FS.