Microtechnology-aided differentiation of human pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells

Vi è un crescente interesse fra la comunità scientifica internazionale, le compagnie farmaceutiche e la ricerca clinica nel trovare delle valide alternative ai modelli standard nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di processi di scoperta di nuovi farmaci. I ricercatori si basano tuttora sull’utilizzo di linee cellulari immortalizzate, cellule primarie estratte da organi e su modelli animali. Queste metodiche sono valide e largamente utilizzate per scopi generali, ma il più delle volte presentano dei limiti evidenti. Le linee cellulari e cellule primarie spesso non riproducono fedelmente le esatte caratteristiche dei tessuti in vivo, poiché perdono alcune caratteristiche fisiche e funzionali quando sono coltivate in vitro. D’altra parte, i modelli animali sono ancora necessari per lo studio di patologie specifiche e nel test di nuovi composti, ma risultano essere dispendiosi in termini di tempo e denaro e spesso mostrano una scarsa capacità predittiva nei confronti degli effetti sull’uomo. Quindi, le cellule staminali pluripotenti umane rappresentano una valida alternativa ai modelli esistenti, grazie alle loro capacità di essere espanse in vitro indefinitamente e di poter differenziare in tutti i tipi cellulari derivanti dai tre foglietti germinali. Negli ultimi anni l’attenzione si è concentrata sui tessuti ingegnerizzati, differenziati a partire da cellule pluripotenti. Questi hanno la possibilità di trasformare radicalmente il modo in cui studiamo in vitro la fisiologia e la patofisiologia umana. Ciò non di meno, vi sono ancora problemi nei processi di differenziamento di cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte umane in vitro. Questo perché si riscontra difficoltà nel dirigere specificamente il destino cellulare verso un determinato tipo cellulare in modo robusto, e per la scarsa riproducibilità delle condizioni fisiologiche in cui questi processi hanno normalmente luogo in vivo. In questo ambito, le nuove micro-tecnologie possono dare un aiuto nell’oltrepassare queste limitazioni, poiché permettono di lavorare in micro-scala in maniera difficilmente riproducibile in condizioni di coltura standard. In questo contesto, lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di differenziare efficacemente cellule staminali pluripotenti umane per riuscire ad ottenere rilevanti tipi cellulari, quali cardiomiociti ed epatociti. La strategia applicata per l’ottenimento di questi modelli umani in vitro si basa sull’applicazione di tecnologie in micro-scala per permettere la riproduzione in vitro delle nicchie fisiologiche, che guidano il differenziamento e permettono lo sviluppo funzionale. In particolare sono stati utilizzati dei micro-pozzetti tridimensionali per modulare l’accumulo di fattori endogeni in corpi embrioidi umani in differenziamento, per studiare lo sviluppo dei tre foglietti germinali guidato da diversi microambienti cellulari. È stata poi imposta una modulazione delle proprietà meccaniche dei nuclei di cellule pluripotenti tramite utilizzo di substrati micro-strutturati, per lo studio della capacità peculiare di deformazione nucleare di tali cellule e si è valutato l’effetto sulla pluripotenza e il differenziamento precoce. Inoltre sono state utilizzate tecnologie micro-fluidiche per modulare selettivamente il microambiente cellulare solubile, in modo da ottimizzare il mantenimento della pluripotenza in chip micro-fluidici, nonché lo sviluppo cellulare precoce e il differenziamento funzionale in cardiomiociti ed epatociti. È stata ottenuta un’alta percentuale di cardiomiociti contrattili nei chip che mostravano risposte funzionali corrette a stimoli di calcio. La tecnologia micro-fluidica ha permesso poi di ottenere un’alta percentuale di epatociti in chip rispetto alle condizioni di coltura standard. Queste cellule mostravano caratteristiche fenotipiche e funzionali corrette, che sono state poi analizzate in condizioni più fisiologiche sotto un gradiente stabile di ossigeno, mimando le condizioni in vivo. Questi tipi cellulari specifici, generati in chip da cellule staminali pluripotenti umane tramite un approccio multi-stadio, mostrano un differenziamento funzionale specifico, che apre a nuove prospettive per test multi-parametrici su larga scala basati su tessuti funzionali umani.