Toll2 signalling safeguards Enteric Nervous System integrity in Drosophila melanogaster

ABSTRACT Studi scientifici e clinici hanno riconosciuto il microbiota intestinale come un organismo essenziale super-responsabile per il mantenimento della salute. Evidenze accumulate indicano che i cambiamenti nella composizione della comunità microbica intestinale sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie, tra cui malattia infiammatoria intestinale (IBD), anche se la popolazione cellulare e il meccanismo molecolare alla base sono ancora incerte. Il microrganismo intestinale interagisce con sensori microbici (ieTLR) in posizione strategica nella mucosa intestinale per generare una segnalazione cruciale nel preservare l'integrità della barriera epiteliale e omeostasi immunitaria locale. Pertanto, l'interruzione del microbiota intestinale e dei segnali derivati secondari di disbiosi o polimorfismi nei sensori microbici (es TLR2 e TLR4) può causare anomalie del sistema nervoso enterico, la rete neuronale distribuiti attraverso la parete intestinale. Poiché il SNE mantiene l'integrità della barriera epiteliale intestinale e l’omeostasi della mucosa immunitaria integrando diverse funzioni, il mancato conferimento dei giusti segnali dalla flora intestinale potrebbe predisporre a disturbi intestinali funzionali o infiammatori. Pertanto, questo progetto mira a identificare il meccanismo molecolare e cellulare dell’asse microbiota intestinale- immunità innata - SNE utilizzando l’organismo modello geneticamente trattabile Drosophila melanogaster. La Drosophila melanogaster è un modello ideale, perché è facile e poco costoso da mantenere, è eticamente ideale per questo progetto, tenendo conto l'elevato grado di conservazione da un punto di vista anatomico e dalle vie dell'immunità innata. Per studiare il ruolo della segnalazione nell'integrità dell'SNE abbiamo usato il sistema UAS-GAL4 per indurre il silenziamento genico tessuto specifico. Così, abbiamo usato una linea driver che esprime la proteina GAL4 sotto il controllo ubiquitario (come tubulina o actina) o cellulo specifico (elav per neuroni o mef per le cellule muscolari lisce) di un promotore con una linea UAS che porta un transgene specifico che in questo caso è una sequenza siRNA per toll. Il sistema GAL4 può essere temperatura e chimicamente (RU486) inducibile. In Drosophile conil toll2 silenziato in maniera ubiquitaria, temperatura inducibile, è stato rilevata una significativa perdita di neuroni HRP +. Inoltre, anche in Drosophile con silenziamento specifico del toll2 in cellule muscolari e cellule gliali abbiamo osservato una drammatica perdita di corpi neuronali HRP +. Le Drosophile con silenziamento delo toll2 sia ubiquitario che cellulo specifico, hanno mostrato un aumento della sopravvivenza rispetto alla linea controllo w1118. In presenza di una sostanza irritante gastrointestinale, destrano solfato di sodio (DSS), abbiamo osservato una ridotta sopravvivenza nei silenziati ubiquitari toll2, rispetto alla linea controllo w1118. Dal momento che la perdita di segnale toll2 sia a livello ubiquitario che cellulo specifico ha causato una significativa perdita di neuroni, abbiamo effettuato una analisi del DNA espressione genica microarray, nell'intestino di actina GAL4 UAS-toll2, elav GAL4 UAS-toll2, mef GAL4 UAS-toll2 e la linea di controllo w1118, per identificare i geni a valle modulati dal segnale del toll2 coinvolti nello sviluppo neuronale e / o la sopravvivenza. Abbiamo identificato diversi geni coinvolti nelle vie notch, implicate nella formazione del sistema nervoso e nella differenziazione e sviluppo neuronale sostenendo ulteriormente l'opinione che i segnali toll2 di derivazione sono necessarie per supportare l’integrità neuronale enterica. Per escludere effetti dipendenti della temperatura siamo passati al sistema UAS GAL4 chimicamente inducibile dalla molecola RU586. Utilizzando i driver ubiquiitari abbiamo ottenuto un efficace silenziamento del toll2 in silenziati ubiquitari, associato a una significativa perdita di neuroni HRP +. Infatti, utilizzando driver cellulo specifici il silenziamento del toll2 è stato osservato nei mef GAL4 UAS-toll2 ma non negli elav GAL4 UAS-toll2. Di conseguenza, il silenziamento del toll2 è stato associato a una significativa perdita neuronale nella linea mef GAL4 UAS-toll2. Inoltre, il silenziamento ubiquitario toll2 utilizzando i driver GAL4 sensibili RU586 ha mostrato una drastica riduzione della sopravvivenza a seguito di esposizione DSS rispetto alla mosche di controllo w1118. In conclusione, utilizzando il modello di Drosophila melanogaster abbiamo dimostrato che i segnali toll2-derivati sono tenuti a sostenere l'integrità neuronale nell'intestino e cellule muscolari lisce sembrano più rilevanti fonti di segnali di sopravvivenza per i neuroni. Questi studi iniziali confermano la fattibilità di questo modello per studiare l’interazione innata immunità-nervi enterici e sezionare percorsi molecolari complessi relativi a patologie caratterizzate da una disfunzione dei nervi enterici.