Photoprotection mechanisms in the moss Physcomitrella patens: Insights on the photosynthesis adaptation during land colonization

La fotosintesi riveste un’importanza fondamentale per la biosfera: grazie a questo processo l’energia solare è utilizzata per fissare l’anidride carbonica atmosferica in biomassa, liberando ossigeno. Piante e alghe, però, sono molto spesso esposte a condizioni d’illuminazione molto variabili. In condizioni di elevata illuminazione è fondamentale che l’energia in eccesso venga dissipata, pena la formazione di specie radicaliche dell’ossigeno (ROS) molto dannose per la cellula. Uno dei principali sistemi di protezione dall’eccesso di luce viene attivato pochi secondi dopo una variazione di illuminazione ed è definito Non Photochemical Quenching (NPQ). L’NPQ permette di dissipare l’eccesso di stati eccitati della clorofilla come calore ed è attivato a seguito dell’acidificazione del pH lumenale. L’NPQ comprende diverse componenti, la più rapida delle quali è definita qE (da “Energy quenching” o “Feedback de-excitation”). L’NPQ è presente in tutti gli organismi fotosintetici anche se meccanismi di attivazione e proteine coinvolte sono diversi. Nelle piante vascolari (quali la pianta modello Arabidopsis thaliana) è noto che l’NPQ dipende da una proteina presente nelle membrane dei tilacoidi chiamata PSBS. Nelle alghe, quali diatomee o la Clorofita Chlamydomonas reinhartii, che pure sono in grado di attivare NPQ, PSBS è assente e l’attivazione dipende da una proteina diversa, detta LHCSR. In questo lavoro è stato utilizzato il muschio Physcomitrella patens come organismo modello per lo studio della regolazione della fotosintesi. Questa scelta è dettata da molteplici ragioni. Le briofite presentano un’interessante posizione evolutiva, dal momento che si sono separate dalle piante vascolari poco dopo la colonizzazione delle terre emerse: il loro studio può quindi fornire informazioni su quelli che sono i primi adattamenti degli organismi fotosintetici alla vita terrestre. Per quanto riguarda i meccanismi di fotoprotezione, Physcomitrella patens ha nel proprio genoma sia PSBS che LHCSR, le proteine indispensabili per l’NPQ nelle piante vascolari e nelle alghe. Physcomitrella, inoltre, presenta la capacità unica tra le piante analizzate fino ad ora di fare ricombinazione omologa, facilitando così la possibilità di ottenere mutanti specifici per le proteine di interesse. Nel particolare, in questo lavoro abbiamo ottenuto dei mutanti specifici per PSBS e LHCSR, le proteine caratteristiche dell’NPQ di piante ed alghe rispettivamente. Sfruttando la capacità di ricombinazione omologa di Physcomitrella, sono stati generati mutanti knock-out (KO) per PSBS (psbs KO) e le due isoforme di LHCSR (LHCSR1 e LHCSR2; lhcsr1 KO e lhcsr2 KO) presenti nel genoma del muschio. Queste mutazioni sono poi stati combinate in doppi KO (psbs lhcsr1 KO, psbs lhcsr2 KO and lhcsr1 lhcsr2 KO) ed in un triplo KO (psbs lhcsr1 lhcsr2 KO), genotipo in cui è stato eliminato il gene di tutte tre le proteine in analisi. La risposta di NPQ nelle varie linee di singoli e doppi KO ha dimostrato come tutti questi mutanti diminuiscano la loro capacità di indurre NPQ rispetto a muschi WT. Ciò nonostante, tutte queste linee sono comunque in grado di attivare una risposta qE, dimostrando che queste proteine non solo sono presenti nel genoma ma sono entrambe attive nell’NPQ. Inoltre, l’isoforma LHCSR1 risulta essere la maggiore responsabile dell’NPQ in questa specie. Al contrario, mutanti privi dei tre polipeptidi (triplo KO) non sono in grado di indurre alcuna risposta qE, con un fenotipo simile ai mutanti di Arabidopsis privi di PSBS. In Arabidopsis PSBS è l’unica proteina coinvolta nel qE, dal momento che le piante vascolari non possiedono geni per LHCSR, confermando ulteriormente che in Physcomitrella sia PSBS che LHCSR sono attive nell’NPQ. Gli effetti di una diminuita capacità di indurre NPQ sulla fotoprotezione di P. patens sono stati ulteriormente approfonditi analizzando la capacità di acclimatazione ad alta luce o basse temperature nel muschio WT e nelle varie linee di mutanti KO ottenute. I mutanti che già in condizioni di controllo mostravano la maggiore diminuzione di NPQ in queste condizioni di crescita mostrano anche la maggiore fotoinibizione, dimostrando l’importanza dell’NPQ per la fotoprotezione. Nei muschi WT, l’acclimatazione ad alta luce o basse temperature, infatti, è accompagnata da un aumento della capacità di attivare la risposta di NPQ che correla con un aumento dell’espressione sia di PSBS che LHCSR. Questi dati dimostrano che Physcomitrella è in grado di modulare la sua capacità di indurre NPQ modificando l’espressione delle proteine chiave di questo processo, PSBS e LHCSR, per ottenere una fotoprotezione adeguata alle condizioni di crescita in cui si trova. In aggiunta a mutanti KO per PSBS e LHCSR, durante questo lavoro sono state generate anche delle linee che over-esprimono (OE) queste proteine. Questi mutanti hanno permesso di dimostrare che sia PSBS che LHCSR sono in grado di attivare una risposta NPQ in Physcomitrella in assenza dell’altra proteina. Questo risultato dimostra che PSBS e LHCSR sono attive in modo indipendente l’una dall’altra, ed hanno quindi verosimilmente dei meccanismi di attivazione differenti ed autonomi. Anche i carotenoidi, e la zeaxantina in particolare, hanno un ruolo fondamentale nella protezione delle cellule dagli stress ossidativi dal momento che sono coinvolti in diversi meccanismi di fotoprotezione. Tra gli altri, la zeaxantina è in grado di amplificare la risposta NPQ in piante quali Arabidopsis. In Physcomitrella abbiamo ottenuto lo stesso risultato, dimostrando che la presenza di questo carotenoide è fondamentale per una completa attivazione di NPQ sia PSBS che LHCSR dipendente. Se queste due proteine non sono presenti, invece, il solo accumulo di zeaxantina non è in grado di attivare alcuna risposta di fotoprotezione rapida qE. Durante questo progetto di Dottorato è stata sfruttata la capacità di ricombinazione omologa di Physcomitrella anche per l’espressione di isoforme mutate di PSBS. Nel particolare, sono state ottenute le sequenze codificanti per PSBS con una delezione all’N- o al C- terminale della proteina matura. Si tratta di regioni conservate in PSBS di diverse specie di piante, che presentano rispettivamente carica positiva e negativa, e potrebbero quindi essere coinvolte in interazioni proteina-proteina che sembrano essere necessarie per il meccanismo di induzione NPQ PSBS-dipendente. L’espressione di queste isoforme in muschi psbs KO, però, ha portato alla complementazione del fenotipo in entrambi i casi, dimostrando che le regioni delete non sono fondamentali per l’attività di PSBS. Nell’ultima parte del lavoro, inoltre, abbiamo focalizzato l’attenzione sull’evoluzione del meccanismo di NPQ da alghe a piante. Come accennato in precedenza, Physcomitrella presenta una posizione evolutiva chiave per ottenere informazioni sugli adattamenti necessari alla colonizzazione delle terre emerse ed abbiamo esteso l’analisi anche ad alghe della linea Streptofita (alghe Carofita) per ottenere maggiori informazioni sull’evoluzione dell’NPQ. I dati ottenuti hanno dimostrato che nelle specie evolutivamente più vicine alle piante terrestri (Coleochatales e Charales, identificati come i probabili “sister group” delle piante terrestri) PSBS è presente. Queste analisi, unitamente a quanto riportato in precedenza per P. patens e a dati di letteratura, permettono di formulare un’ipotesi sull’evoluzione dell’NPQ da alghe a piante: in corrispondenza della colonizzazione delle terre emerse è stato evoluto un nuovo meccanismo di fotoprotezione (PSBS dipendente), che dapprima si è affiancato, poi sostituito completamente a quello LHCSR-dipendente tipico delle alghe.