Physiopathological characterization of the role of MCUb in skeletal muscle regeneration

Il Ca2+ riveste un ruolo fondamentale nella regolazione di un vasto spettro di processi biologici e fisiologici come la proliferazione cellulare, la trascrizione genica, la stimolazione del metabolismo aerobico, la regolazione della contrazione muscolare, l’esocitosi e la plasticità sinaptica [1,2]. I principali organelli intracellulari predisposti alla regolazione della concentrazione di Ca2+ citosolica ([Ca2+]cit) sono i mitocondri. Quest’ultimi hanno la capacità di accumulare molto velocemente elevate [Ca2+][3] che in alcuni tessuti possono raggiungere livelli superiori ai 100 µM [4]. L’alterato rilascio di Ca2+ dalle riserve intracellulari, il danno mitocondriale o il malfunzionamento dei recettori e canali presenti nella loro membrana possono portare ad un accumulo eccessivo di Ca2+ all’interno del mitocondrio, fenomeno che è stato dimostrato condurre ad una crisi energetica con conseguente induzione di morte cellulare [2]. In condizioni fisiologiche, il Ca2+ mitocondriale riveste un ruolo fondamentale nella sopravvivenza e metabolismo cellulare sostenendo la produzione dell’adenosina trifosfato (ATP), la principale molecola energetica della cellula, necessaria per lo svolgimento di diverse funzioni cellulari [5,6]. Di conseguenza, lo studio del ruolo dei mitocondri nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+ è diventato cruciale per la comprensione di una elevata serie di funzioni cellulari. Sfortunatamente, l’analisi di questo aspetto è stata fortemente limitata dalla mancata caratterizzazione molecolare della proteina responsabile dell’accumulo di Ca2+ mitocondriale. Nel 2011, nel nostro laboratorio e in quello del Prof. Mootha è stata scoperta l’identità molecolare dell’uniporto del Ca2+ mitocondriale (MCU), proteina necessaria e sufficiente a permettere l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio [7,8]. Questa scoperta ha permesso l’identificazione di vari componenti dell’uniporto e dei meccanismi che regolano la sua funzione [9]. E’ ormai chiaro che MCU esiste sotto forma di un complesso, costituito da diverse subunità che compongono la regione del poro (MCU, MCUb, EMRE) e da subunità regolatorie (MICU1, MICU2) [7,10–13]. Tra le varie subunità che compongono il complesso, un ruolo rilevante è svolto da MCUb. Questa subunità è stata identificata nel 2013 nel nostro laboratorio come parte integrante della regione formante il poro del canale [10]. Abbiamo dimostrato che MCUb agisce come dominante negativo di MCU in quanto inibisce l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio [10]. Nonostante l’elevata similarità in sequenza e struttura, MCU e MCUb mostrano un diverso grado di espressione nei diversi tessuti (es: rapporto di 3:1 nel cuore e polmone e di 40:1 nel muscolo scheletrico). E’ stato ipotizzato che queste differenze possano contribuire alla regolazione spazio-temporale dell’ingresso di Ca2+ mitocondriale nei diversi tessuti [10]. Coerentemente, il diverso grado di espressione di MCU e MCUb nei vari tessuti correla con dati ottenuti da esperimenti di patch clamp in cui è stato misurato l’accumulo di Ca2+ in mitocondri isolati da diversi tessuti [14]. Esperimenti di Real Time-PCR da noi condotti hanno dimostrato una elevata induzione dell’espressione di MCUb durante il corso della rigenerazione del muscolo scheletrico 3 giorni dopo il danno indotto da cardiotossina (CTX). Questa induzione è specifica in quanto l’espressione delle altre componenti del canale è inalterata in questa condizione. Dal momento che, in condizioni basali, MCUb è poco espresso nel muscolo scheletrico e che la sua espressione aumenta significativamente e specificamente durante il corso della rigenerazione muscolare, abbiamo ipotizzato che MCUb potesse avere un ruolo fondamentale in questo processo. In aggiunta, MCUb è specificatamente espresso in macrofagi con fenotipo anti-infiammatorio (M2), facendo ipotizzare che l’aumento significativo di MCUb, osservato durante il corso della rigenerazione, potesse essere attribuito alla componente macrofagica. Infatti, i macrofagi di tipo M2, che infiltrano massivamente un muscolo rigenerante, partecipano attivamente durante le ultime fasi che caratterizzano questo processo [15–17]. Risultati ottenuti da esperimenti effettuati in vitro hanno dimostrato che il silenziamento di MCUb nei macrofagi impedisce a quest’ultimi di acquisire un fenotipo di tipo M2. Questo dato fa emergere l’ipotesi che MCUb, in vivo, possa rivestire un ruolo fondamentale nella polarizzazione dei macrofagi dal tipo M1 al tipo M2 e in questo modo influire sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in seguito a danno. Per confermare le nostre ipotesi, sono stati condotti degli esperimenti di rigenerazione del muscolo scheletrico utilizzando un modello murino in cui MCUb è stato deleto in tutti i tessuti (MCUb knockout (KO)). I nostri risultati dimostrano che la mancanza di MCUb, durante il corso della rigenerazione muscolare, impedisce la polarizzazione dei macrofagi da un fenotipo pro-infiammatorio (M1) a quello anti infiammatorio (M2). E’ ormai ampiamente accettato il concetto che i macrofagi di tipo M1 e M2 influenzino il corso della rigenerazione muscolare attraverso il rilascio di citochine e fattori di crescita che facilitano la risoluzione del danno [15]. In particolare, i macrofagi di tipo M1 promuovono l’attivazione e proliferazione delle cellule satellite mentre gli M2 sono coinvolti negli ultimi stadi della rigenerazione promuovendo il differenziamento e la fusione dei precursori delle cellule muscolari (MPCs ) [15]. Abbiamo quindi ipotizzato che la mancata transizione dei macrofagi dal profilo pro-infiammatorio (M1) a quello anti-infiammatorio (M2) potesse influenzare negativamente l’espressione di geni codificanti fattori di trascrizione coinvolti nelle varie fasi di riparazione del muscolo scheletrico in seguito a trauma. Questa ipotesi sembra confermata. Infatti, l’espressione di Pax7 e di Myod, regolatori cruciali del processo di proliferazione e differenziamento delle cellule satelliti [18,19], appare essere drasticamente ridotta nei topi MCUb KO rispetto ai topi di controllo durante il corso della rigenerazione muscolare, suggerendo un’alterazione del processo di rigenerazione muscolare in mancanza di MCUb. Questi risultati supportano l’ipotesi che l’alterato fenotipo muscolare osservato nei topi KO possa essere ricondotto alla mancata transizione dei macrofagi dal fenotipo di tipo M1 a quello di tipo M2, considerato che quest’ultimi sono dotati di capacità pro-regenerative [15–17]. Ulteriore conferma del fatto che l’assenza di MCUb possa influenzare negativamente la transizione fenotipica dei macrofagi da M1 a M2, deriva dalla dimostrazione che i macrofagi derivanti dal topo MCUb KO, mostrano una riduzione dell’attività fagocitica, funzione essenziale per la polarizzazione dei macrofagi verso un fenotipo di tipo M2 [20]. Un altro parametro attraverso il quale è stato possibile valutare l’efficienza della rigenerazione del muscolo scheletrico, si basa sull’osservazione che il numero di fibre rigeneranti nei topi KO risulta significativamente ridotto rispetto alle fibre dei topi di controllo 14 giorni dopo l’induzione del danno. E’ noto che, durante il corso della rigenerazione muscolare, le cellule satelliti che non vanno incontro al processo di differenziamento, ritornino ad uno stato di quiescenza andando a ricostituire la nicchia di cellule satelliti originarie che verranno attivate in seguito ad ulteriore trauma [21]. Con lo scopo di valutare se i topi MCUb KO mostrino un’alterazione nella ricostituzione della riserva di cellule satelliti in seguito a danno muscolare, abbiamo condotto degli esperimenti di tripla rigenerazione, come precedentemente effettuato [22], e abbiamo osservato una sostanziale riduzione dell’area delle fibre rigeneranti dei topi KO rispetto a quelle dei topi controllo. Da questi risultati è emersa l’ipotesi che l’assenza di MCUb possa impedire la ricostituzione del pool di cellule satellite, alterando, in questo modo, il normale decorso della rigenerazione. In linea con questi dati abbiamo osservato come l’ablazione di MCUb, impedendo la polarizzazione dei macrofagi di tipo M2, influenzi negativamente la quantità di collagene, componente essenziale della matrice extracellulare [16], depositata durante la fase di riparazione muscolare. Questi risultati sono in linea con dati presenti in letteratura che dimostrano il ruolo dei macrofagi di tipo M2 nella produzione di collagene [16]. La dimostrazione che l’espressione di MCUb sia indotta nei macrofagi di tipo M2 ci ha spinti allo studio dei meccanismi che regolano la trascrizione di MCUb in questa sottopopolazione di cellule. In particolare, abbiamo dimostrato come l’IL-4, citochina di tipo anti-infiammatorio, attivi la trascrizione di MCUb. Dal momento che l’ablazione di MCUb nei macrofagi impedisce la loro polarizzazione verso un fenotipo di tipo M2, abbiamo ipotizzato che la via di segnale mediata dall’asse IL-4-STAT6, nota per essere coinvolta nella polarizzazione dei macrofagi M2 [23], possa essere coinvolta nell’attivazione della trascrizione di MCUb. In futuro, analizzeremo lo stato di fosforilazione di AMPK, uno dei principali sensori metabolici cellulari, che è stato dimostrato essere un giocatore essenziale nella transizione dei macrofagi dal fenotipo M1 a quello M2 [20]. La nostra ipotesi è che, MCUb, regolando negativamente l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio e quindi la produzione di ATP, possa indurre l’attivazione di vie di segnale mediate da AMPK influenzando, in questo modo, la polarizzazione dei macrofagi. E’ ormai noto che perturbazioni nella funzionalità e attivazione dei macrofagi possano portare ad alterazioni nel processo rigenerativo e alla deposizione di tessuto fibrotico, come descritto in diverse condizioni patologiche [15]. Questa condizione è una caratteristica comune a diverse patologie come le distrofie muscolari e durante l’invecchiamento [25]. Per questo motivo, la nostra ricerca potrebbe rivelarsi fondamentale per la comprensione delle basi molecolari di malattie croniche del muscolo scheletrico, come la distrofia di Duchenne (DMD) e potrebbe portare all’identificazione di nuovi bersagli ter