Non-genomic Mechanisms in the Regulation of Glycolytic Proteins by Estrogen Receptor Ligands in Cells with High Glycolytic Reliance

Il 17beta-estradiolo (E2) ha molti effetti sul metabolismo tissutale e cellulare con implicazioni fisiologiche e patologiche. Sono stati condotti pochi studi sui meccanismi che collegano i segnali ormonali alla domanda metabolica in cellule a metabolismo glicolitico, come le cellule endoteliali (CE). Abbiamo evidenziato che E2 innesca il processo angiogenetico attraverso il recettore di membrana GPER e la proteina glicolitica PFKFB3 come effettore a valle. In particolare, E2 aumenta rapidamente i livelli della proteina PFKFB3 senza influenzarne l’mRNA, suggerendo che nelle CE, E2 controlla la glicolisi attraverso meccanismi non-genomici. Lo scopo della tesi è stato quello di investigare se gli agenti estrogenici contribuiscano al rapido adattamento metabolico delle CE, regolando i livelli di proteine glicolitiche attraverso meccanismi non-genomici, implicati nella stabilità e/o nella degradazione proteica. Similmente a E2, l’agonista selettivo di GPER aumenta i livelli di proteina ma non di mRNA di PFKFB3. Quando la sintesi proteica viene inibita, il trattamento con E2 o G1 prevengono la degradazione di PFKFB3. Inoltre, l’inibitore selettivo di una E3 ligasi così come l’inibitore del proteasoma, aumentano i livelli di PFKFB3. In linea con questo risultato, abbiamo dimostrato che la quantità di ubiquitina legata a PFKFB3 è minore nelle CE trattate con E2 o con G1. Entrambi i ligandi aumentano i livelli di deubiquitinasi USP19 mentre il siRNA specifico di GPER contrasta questo effetto. Inoltre, il trattamento con E2 o con G1 aumenta l'espressione di GLUT1 attraverso un meccanismo non trascrizionale. Abbiamo anche osservato che il trattamento con E2 non influenza la stabilità di GLUT1, suggerendo il coinvolgimento di meccanismi diversi dalla degradazione. I miRNA contribuiscono alla regolazione post-trascrizionale delle proteine e la loro azione porta alla repressione della traslazione. Poiché nelle cellule di carcinoma mammario E2 aumenta i livelli di PFKFB3 riducendo l'espressione di miRNA-206 e -26, abbiamo ipotizzato che gli agenti estrogenici regolassero le proteine glicolitiche tramite miRNA condivisi. Abbiamo creato un vettore contenente la regione 3′-UTR di PFKFB3 legata alla luciferasi. Non essendo riusciti a trasfettare in modo efficiente il vettore nelle CE, abbiamo utilizzato le cellule SKOV3. Abbiamo osservato che il trattamento con gli agenti estrogenici non modifica la proliferazione delle SKOV3, ma induce la migrazione delle stesse. Inoltre, abbiamo dimostrato che E2 aumenta la proteina PFKFB3 ma non i livelli di mRNA. Per esplorare il ruolo di miRNA specifici nel turnover di PFKFB3 e l'interazione con agenti estrogenici, abbiamo trasfettato efficacemente le cellule SKOV3 con il vettore contenente PFKFB3-3'UTR. Abbiamo scoperto che i miRNA-26b e -206 riducono l'attività della luciferasi rispetto al controllo negativo. Coerentemente, la sovraespressione di miRNA-26b e miRNA-206 riducono significativamente i livelli di proteina PFKFB3; il pretrattamento con E2 non reverte l'effetto dei miRNA. In conclusione abbiamo dimostrato che il recettore di membrane GPER media la regolazione post-trascrizionale di GLUT1 e PFKFB3 nell’endotelio. Abbiamo rivelato nuovi meccanismi che associano i segnali ormonali alla domanda metabolica in cellule che si basano sulla glicolisi per esercitare le loro funzioni, dimostrando che gli agenti estrogenici nelle cellule endoteliali aumentano la quantità a) della proteina GLUT1 ma non del suo mRNA e b) della proteina PFKFB3 riducendone la sua degradazione attraverso un aumento dei livelli della deubiquitinasi USP19; inoltre, c) E2 controlla i livelli di proteina PFKFB3 nelle cellule SKOV3 attraverso meccanismi post-trascrizionali, probabilmente attraverso il coinvolgimento dei miRNA.