Improving key root traits in sugar beet: Fusarium resistance

Il miglioramento genetico delle piante coltivate, basato sull’esplorazione, sull’utilizzo delle risorse genetiche e sulla ricerca genomica avanzata, è prioritario per soddisfare il fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in costante crescita. In particolare, l’introgressione di tratti desiderabili come la resistenza alle malattie e la maggior resa produttiva è fondamentale per garantire la sicurezza alimentare a livello globale. Per accelerare il miglioramento delle piante è essenziale predire le variazioni fenotipiche sviluppando marcatori molecolari legati ai tratti in esame. La selezione assistita da marcatori molecolari può ridurre costi e tempi di ottenimento di nuove varietà rispetto alla selezione basata solo su variazioni fenotipiche. Fra i marcatori molecolari disponibili, le mutazioni di singola base (SNP) sono i più diffusi. La barbabietola da zucchero (Beta vulgaris L.) è la seconda fonte di zucchero al mondo ed è coltivata in tutte le aree temperate. La coltura è colpita da numerosi patogeni e, fra questi, il fungo Fusarium oxysporum causa severi danni. Due differenti forme speciali di Fusarium, Fusarium oxysporum f. sp. betae (Fusarium yellows) e Fusarium oxysporum f. sp. radicis-betae (Fusarium root rot) sono state identificate in barbabietola. La malattia è caratterizzata da avvizzimento e clorosi fogliare con un progressivo deperimento delle foglie, spesso seguito dalla morte dell’intera pianta. I sintomi interni consistono in una discolorazione vascolare con imbrunimento dei fasci vascolari e, nel caso di marciume radicale, è presente un caratteristico annerimento all’esterno della radice principale. Per il controllo del patogeno, l’impiego di fungicidi e le rotazioni colturali non sono efficaci. L’introgressione di geni di resistenza dal germoplasma selvatico è ritenuta la strategia principale per la difesa della coltura. Questo richiede lo sviluppo di marcatori molecolari legati ai geni di resistenza per la selezione assistita degli individui resistenti. Gli obiettivi del lavoro di tesi sono stati i seguenti: (i) valutare la risposta a Fusarium oxysporum f. sp. betae di un’ampia collezione di linee di barbabietola da zucchero (ii) identificare linee resistenti a Fusarium oxysporum da poter utilizzare in futuri programmi di miglioramento genetico e (iii) identificare marcatori molecolari SNP (polimorfismi del DNA a singolo nucleotide) legati alla resistenza a Fusarium da utilizzare in programmi di selezione assistita da marcatori. Il primo contributo del lavoro di tesi descrive lo stato dell’arte dei risultati ottenuti nel miglioramento genetico della barbabietola da zucchero. Il contributo si focalizza sui progressi ottenuti nella resistenza a malattie con metodi di miglioramento genetici classico e con l’impiego di tecniche molecolari utilizzando come fonte di resistenza germoplasma selvatico. E’ stato inoltre considerato il contributo delle nuove tecnologie di sequenziamento e del recente rilascio del genoma di riferimento al miglioramento genetico della barbabietola. Il secondo contributo riguarda la valutazione della risposta a Fusarium oxysporum f. sp. betae di un’ampia collezione di linee di barbabietola da zucchero al fine di identificare linee resistenti e suscettibili. Per raggiungere questo scopo sono state esaminate 29 linee di barbabietola da zucchero. Le piante sono state infettate con due isolati fungini F19 e Fob220a, appartenenti a due gruppi genetici distinti, entrambi altamente patogenici. Dopo l’inoculo, per un periodo di sei settimane, è stato attribuito, per ciascuna pianta, un punteggio da 0 a 5 in base ai vari sintomi di malattia manifestati, quali: avvizzimento fogliare, clorosi e necrosi. Successivamente, le piante sono state raccolte e le radici sono state esaminate per vedere dove era presente marciume radicale, discolorazione e quali piante invece risultavano resistenti al patogeno. Il terzo contributo descrive la risposta di due diverse collezioni di germoplasma di barbabietola da zucchero a isolati di Fusarium oxysporum f. sp. betae. Linee suscettibili, provenienti da USDA-ARS (US) e UNIPD (Università di Padova, Italia), sono state inoculate con tre distinti isolati di Fusarium oxysporum f. sp. betae, l’agente causa di Fusarium yellows. Tutte le linee inoculate hanno sviluppato i sintomi della malattia, ma un grave marciume radicale è stato osservato solo nelle linee provenienti da UNIPD inoculate con isolati che non avevano mai causato marciume radicale nel germoplasma USDA. Il quarto contributo riguarda l’identificazione, su geni candidati, di marcatori molecolari SNPs associati alla resistenza alla malattia. In particolare, sono stati identificati 5 analoghi a geni di resistenza (RGA) dal lavoro di Dohm et al. 2014 e sono stati analizzati tramite analisi High Resolution Melting (HRM) su 96 campioni delle 6 linee più resistenti e più suscettibili a Fusarium. Due varianti, in 2 dei geni testati, sono risultate significativamente associate (p < 0.01) con la resistenza a Fusarium. Le varianti sono state validate attraverso sequenziamento Sanger. Il sequenziamento ha permesso di individuare due marcatori SNPs. L’associazione tra questi due SNPs e la resistenza a Fusarium è stata successivamente validata con il metodo di genotipizzazione Comparative allele-specific PCR (KASPar) su 96 campioni resistenti e 96 campioni suscettibili. La frequenza dell’allele A sia per lo SNP_Bv7_171470 e lo SNP_Bv2_043450 è risultata significativamente più alta negli individui resistenti rispetto a quelli suscettibili. Questi due SNPs potranno essere utilizzati in programmi di selezione genetica al fine di migliorare la resistenza a Fusarium in barbabietola da zucchero.