Profiling the molecular mechanisms driving the fate of human B cells in response to vaccination

Nell’ambito del processo di attivazione dovuto all’interazione con l’antigene (Ag), le cellule B proliferano e iniziano un processo di maturazione terminale attraverso la formazione dei centri germinativi (GC). All’interno dei GC, a seguito dell’ipermutazione somatica delle regioni variabili del recettore delle cellule B (BCR) ed il cambiamento di isotipo delle immunoglobuline, i cloni che hanno raggiunto alta affinità per l’Ag possono andare incontro a due possibili destini: differenziamento in plasmablasti (PB) che secernono anticorpi (Ab) o in cellule B della memoria quiescenti (MBC). Il meccanismo molecolare che determina il destino delle cellule B umane durante il differenziamento tardivo in PB o MBC è poco conosciuto. Studi recenti hanno rivelato nuovi aspetti del programma trascrizionale responsabile della maturazione di cellule B in topo o in popolazioni di cellule umane, ma la disponibilità limitata di campioni e la difficoltà nell'isolamento di MBC Ag-specifiche da sangue periferico hanno reso l’analisi di questi tipi cellulari particolarmente complicata. Per questo sono stati raccolti campioni di sangue da donatori sottoposti a vaccinazione stagionale contro l’influenza. Questi campioni sono stati processati immediatamente dopo il prelievo, effettuato in corrispondenza di due particolari momenti: 8 e 22 giorni dopo la vaccinazione, rispettivamente picchi della risposta mediata da PB e da MBC . I campioni di sangue periferico sono stati usati per l’isolamento di PB, NAIVE e MBC Ag-specifiche sfruttando marcatori di superficie. Per l’analisi del profilo di espressione genica è stato ottimizzato un metodo che permette di effettuare qPCR di numerosi geni in cellule B umane isolate come singola cellula. Tale approccio è stato usato inizialmente per uno studio pilota dell’espressione di 21 geni di interesse su cellule isolate da un primo soggetto, permettendoci di discriminare cellule appartenenti alle tre diverse popolazioni. Successivamente questo protocollo è stato ottimizzato sfruttando la tecnologia del 96.96 Dynamic Array prodotto da Fluidigm, sistema che permette di effettuare RT-qPCR su 96 singole cellule per 96 geni in una singola reazione. Con questo metodo ad alta resa abbiamo analizzato 240 singole cellule appartenenti alle popolazioni di MBC Ag-specifiche, PB e NAIVE (80 cellule ciascuna) di un secondo soggetto, permettendoci di analizzare il profilo di espressione di 96 geni coinvolti nelle vie di differenziamento delle cellule B. Attraverso un’analisi statistica di raggruppamento gerarchico dei dati di espressione appartenenti a tutti i campioni processati, abbiamo riunito sotto tre gruppi diversi per espressione genica le cellule appartenenti alle tre diverse popolazioni e abbiamo identificato i geni che le caratterizzano. La Linear Discriminant Analysis, una tecnica di riduzione dimensionale supervisionata, sottolinea come i PB siano particolarmente differenti da MBC Ag-specifiche e NAIVE, che invece condividono un profilo più simile. Sfruttando diversi metodi di analisi statistica, sono stati identificati i geni significativamente espressi in maniera diversa tra le tre popolazioni. Così facendo sono stati individuati sia geni il cui ruolo nella maturazione delle cellule B è noto, sia geni conosciuti principalmente per la loro funzione in altri processi o altre fasi dello sviluppo di queste cellule (FOXP1, POU2AF1, IRF2). Inoltre abbiamo confrontato i profili di espressione delle MBC Ag-specifiche con MBC isolate da un donatore sano non vaccinato, per identificare possibili differenze nei profili di espressione di MBC recentemente attivate e MBC circolanti, lontane dall'attivazione Ag-specifica. Tale analisi ha identificato 16 geni espressi differentemente in maniera significativa, evidenziando un profilo di espressione che denota uno stato di attivazione per le MBC recentemente contattate dall'Ag. Per studiare ulteriormente l’eterogeneità delle MBC Ag-specifiche, tramite PCR abbiamo amplificato e sequenziato le regioni variabili delle catene pesanti (VH) delle immunoglobuline espresse dalle stesse cellule, ma gli studi di correlazione mostrano solo deboli associazioni tra maturazione del BCR (in termini di tasso di mutazione delle VH) e dati di espressione genica. Al contrario, è stata individuata associazione significativa tra la selezione dell'isotipo del BCR e l’espressione di due geni, in particolare l’espressione di RORα è associata alla classe IgA, mentre TBX21 all’IgG, in accordo con studi precedenti effettuati in popolazioni di cellule B murine. In conclusione, i geni identificati da questo studio come discriminanti delle MBC recentemente attivate dall'Ag potrebbero essere ulteriormente studiati in qualità di potenziali marker della risposta B alla vaccinazione in uomo.