Stem cells in molecular and regenerative medicine

Le cellule staminali sono una popolazione cellulare con la particolare capacità di moltiplicarsi indefinitamente autorinnovandosi e di differenziarsi in cellule mature di qualsiasi altro tessuto attraverso il processo di differenziazione. In particolare l'utilizzo delle cellule staminali adulte costituisce una promettente applicazione nel campo della medicina rigenerativa, la riparazione dei tessuti e la terapia genica. Le cellule staminali adulte da midollo osseo (BMCs) comprendono due popolazioni cellulari: le cellule staminali ematopoietiche (HSCs), dalle quali originano tutte le cellule mature del sangue, e le cellule staminali mesenchimali (MSCs) che possono differenziare in osteoblasti, condrociti, adipociti, miociti, tenociti e cellule stromali di supporto per l'ematopoiesi. In condizioni normali l'autorinnovamento della popolazione staminale è strettamente regolato sia da segnali estrinseci che intrinseci ed un'alterazione di questo equilibrio può portare all'instaurarsi di un cancro. In questa tesi abbiamo analizzato due differenti aspetti delle cellule staminali: le cellule staminali che danno origine a leucemia nella leucemia mieloide acuta (AML) e l'utilizzo delle cellule staminali nella medicina rigenerativa. Nella prima parte del lavoro abbiamo approfondito il meccanismo molecolare dell' AML-ETO, risultato della traslocazione genica t(8:21) che viene associata alla trasformazione leucemica. La leucemia mieloide acuta (AML) è definita come un gruppo eterogeneo di disordini clonali causati dalla trasformazione maligna di cellule staminali o progenitori staminali di derivazione midollare, che mostrano un aumento della capacità proliferativa così come un differenziamento aberrante che porta ad una insufficienza ematopoietica (per esempio: granulocitopenia, trombocitopenia o anemia). Questi tipi di leucemia sembrano essere il risultato dell'acquisizione di riarrangiamenti cromosomici e mutazioni geniche multiple da parte delle cellule ematopoietiche multipotenti o di progenitori cellulari più differenziati e indirizzati verso una linea cellulare specifica, che risultano così trasformati in cellule staminali leucemiche o cellule inizianti la leucemia, che mantengono la capacità di autorinnovamento. L' AML è solitamente considerata una malattia delle cellule staminali e comunemente presenta alterazioni sia a livello genetico che epigenetico. L' AML è la forma più comune di leucemia acuta che colpisce soprattutto la popolazione adulta e la sua incidenza aumenta con l'età. Gli attuali approcci terapeutici hanno come target le cellule staminali leucemiche e la popolazione leucemica per intero. E' quindi di cruciale importanza riuscire a determinare e caratterizzare l'esatto meccanismo molecolare coinvolto nella trasformazione leucemica per lo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici. I pazienti affetti da AML che manifestano la traslocazione t(8:21) hanno una prognosi intermedia e l'identificazione di ampi eventi genici in questo subset delle AML è clinicamente rilevante in quanto potrebbe portare alla comprensione dei meccanismi molecolari della progressione della malattia. A questo scopo sono stati analizzati i pattern di legame al DNA di AML1-ETO nelle cellule di linea AML e nei blasti di AML. Abbiamo dimostrato che AML1-ETO lega preferenzialmente le regioni che contengono le sequenze di consenso RUNX1/AML1 e ETS e che i siti di legame di AML1-ETO si sovrappongono invariabilmente a quelli di HEB e parzialmente a quelli di CBFβ, RUNX1/AML1 così come accade per i fattori ETS, quali ERG e FLI1. Le successive analisi sulle cellule t(8;21) e t(15;17) (un'altra traslocazione associata con l' AML) hanno evidenziato il legame di fattori ETS specifici per questi tipi cellulari e il legame preferenziale di AML1-ETO ai siti di legame per i fattori ETS specifici per il tipo cellulare. Inoltre è stato anche scoperto che il legame di un fattore ETS, ERG, correla con un segnale di acetilazione istonica "attiva". Presi insieme questi risultati suggeriscono che i fattori ETS demarcano i siti regolatori ematopoietici che forniscono un target per la regolazione epigenetica (aberrante) da parte delle proteine di oncofusione. Nella seconda parte di questa tesi è stata testata la possibilità di ottenere in vitro un esofago ingegnerizzato composto da matrice acellulare esofagea e cellule staminali mesenchimali (MSCs) che potesse essere impiantato in vivo. Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) nei vertebrati sono precursori multipotenti di molte linee cellulari di origine mesodermica e vengono ottenute per la maggior parte dal midollo osseo. Alcune caratteristiche delle MSCs, inclusa la capacità di migrare verso i siti di infiammazione, la facilità di trasduzione e la perdita di immunogenicità, suggeriscono che queste cellule possano essere potenzialmente utilizzabili nella medicina rigenerativa. I probabili usi terapeutici includono la possibilità di rigenerare un tessuto danneggiato, agendo come veicolo per il trasporto di transgeni terapeutici, di supportare altri tipi cellulari per il riparo tessutale, e di modulare la reazione immunitaria dell'ospite nei confronti delle cellule o dei tessuti co-trapiantati. L'uso delle MSCs permette di evitare i problemi di natura etica e morale associati all'utilizzo delle cellule staminali di origine embrionale; inoltre le MSCs hanno già dimostrato la loro efficacia in studi preliminari che prevedevano la loro applicazione in ingegneria tessutale. I materiali artificiali e i tessuti autologhi utilizzati per la ricostruzione dell'esofago spesso comportano complicazioni come stenosi e rottura dell'impianto nei follow-up a lungo termine. Nel presente studio è stata valutata l'adesione delle MSCs ad una matrice acellulare di esofago per la costruzione di un tessuto esofageo ingegnerizzato. Le MSCs sono state isolate da midollo osseo di coniglio, caratterizzate, espanse in vitro e seminate su una matrice esofagea di coniglio. Le matrici acellulari ottenute attraverso un metodo detergente-enzimatico non presentavano marker per il complesso maggiore di istocompatibilità. Inoltre supportavano l'adesione cellulare e in non più di 24 ore dalla semina lo scaffold appariva completamente coperto dalle MSCs sia in condizione statica che in bioreattore. Complessivamente questi risultati suggeriscono che i tessuti ingegnerizzati composti da matrice acellulare omologa e MSCs autologhe possono rappresentare un promettente approccio per il riparo di danni all'esofago