APPROCCI BIOCHIMICI PER INVESTIGARE L’ETEROGENEITÀ FENOTIPICA DEL TUMORE ALLA MAMMELLA

Breast cancer (BC) is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer-related mortality among women worldwide, with 2.3 million diagnoses and over 660,000 deaths in 2022. Despite improved survival rates due to increased screening activities, incidence is projected to rise by 46.5% in the coming decades. What really challenges BC management, from diagnosis to treatment selection, is its complexity, that reflects in inter- and intra-tumor heterogeneity. This complexity finds its main cause in the multifactoriality constituting the tumor-microenvironment (TME), where hypoxia is a key player affecting immune infiltration, tumor metabolism and stemness properties. Among the different BC subtypes, Luminal B-like HER2-negative (LumB-like HER2-) represents the most heterogeneous one, whose heterogeneity results in diverse disease outcomes despite seemingly homogeneous diagnoses. The aim of the study is to (i) evaluate the biochemical features underlying the heterogeneity of this subtype and identify markers for patient stratification based on recurrence risk and potential benefit from adjuvant chemotherapy (AC); (ii) and assess, for the first time, the role of a novel 3D cell model in reproducing tumor hypoxic core phenotype in vitro. Proteomics analyses and epigenetic evaluation of histone tail modifications identified three different LumB-like HER2- risk-of-relapse based classes: low risk of relapse (no AC needed), intermediate risk of relapse (AC beneficial), and high risk of relapse (AC resistant). Each class exhibits unique protein markers with potential clinical value and molecular pathway activation in a subcellular localization basis. Furthermore, differences in the histone code suggest a potential link between chromatin state and relapse risk, with a progressive increase in chromatin accessibility as the risk of relapse escalates. Future research will focus on validation of risk-of-recurrence markers, focusing on their spatial relevance and stratification efficacy in a larger cohort of patients, and investigation of differential chromatin accessibility according to the different risk of relapse. Spheroid treatment in the ClinoStar hypoxic chamber by CelVivo® affects, not only size and morphology of the 3D BC structures, but also protein expression, with specific markers characterizing all subcellular compartments and enhancement of hypoxia-related pathways and activation of key signaling cascades. Moreover, hypoxic atmosphere exposure induces changes in histone tail modifications, leading to a more repressing chromatin state. Therefore, this system can be considered a robust platform to model tumor hypoxic core phenotype and study its unique features.

Il carcinoma alla mammella (CM) rappresenta la neoplasia più frequentemente diagnosticata e la principale causa di mortalità legata al cancro nella popolazione femminile globale, con 2,3 milioni di diagnosi e oltre 660.000 decessi registrati nel 2022. Nonostante il miglioramento dei tassi di sopravvivenza dovuto all'aumento delle attività di screening, nei prossimi decenni è previsto un aumento dell'incidenza del 46,5%. La più grande sfida nella gestione del CM, dalla diagnosi alla scelta del trattamento, è la sua complessità, che si riflette nell'eterogeneità inter- e intra-tumorale. Questa complessità trova la sua causa principale nella multifattorialità che costituisce il microambiente tumorale (TME), dove l'ipossia è un elemento chiave che influenza l'infiltrazione immunitaria, il metabolismo tumorale e le proprietà staminali. Tra i diversi sottotipi di CM, il Luminale B-like HER2-negativo (LumB-like HER2-) rappresenta quello più eterogeneo, la cui eterogeneità si traduce in esiti patologici diversi nonostante diagnosi apparentemente omogenee. Il presente studio si prefigge di (i) valutare le caratteristiche biochimiche alla base dell'eterogeneità di questo sottotipo e identificare i marcatori per la stratificazione delle pazienti in base al rischio di recidiva e al potenziale beneficio della chemioterapia adiuvante (AC); (ii) valutare, per la prima volta, il ruolo di un nuovo modello cellulare 3D nel riprodurre il fenotipo del nucleo ipossico tumorale in vitro. Le analisi di proteomica e la valutazione epigenetica delle modificazioni istoniche hanno permesso di identificare tre diverse classi di rischio di recidiva LumB-like HER2: basso rischio di recidiva (senza necessità di AC), rischio intermedio di recidiva (dove AC è di beneficio) e alto rischio di recidiva (resistente all'AC). Ogni classe presenta marcatori proteici unici con un potenziale valore clinico e l'attivazione di vie molecolari in base alla localizzazione subcellulare. Inoltre, le differenze nel codice istonico suggeriscono un potenziale legame tra lo stato della cromatina e il rischio di recidiva, con un aumento progressivo dell'accessibilità della cromatina all'aumentare del rischio. In futuro, sarà effettuata la validazione dei marcatori di rischio di recidiva identificati, approfondendo la loro rilevanza spaziale e l’efficacia di stratificazione in una coorte più ampia di pazienti, e la validazione dell'accessibilità cromatinica differenziale in base al diverso rischio di recidiva. Il trattamento degli sferoidi nella camera ipossica ClinoStar di CelVivo® influenza non solo le dimensioni e la morfologia delle strutture tridimensionali del CM, ma anche l’espressione proteica, con marcatori specifici che caratterizzano tutti i compartimenti subcellulari e il potenziamento delle vie correlate all'ipossia e l'attivazione di cascate di segnalazione chiave. Inoltre, l'esposizione all'atmosfera ipossica induce cambiamenti nelle modificazioni istoniche, portando a uno stato cromatinico più repressivo. Pertanto, questo modello può essere considerato una piattaforma robusta per riprodurre il fenotipo del nucleo ipossico del tumore e studiarne le caratteristiche uniche.