ROLE OF EXTRACELLULAR VESICLES IN THE ASSOCIATION BETWEEN AIR POLLUTION EXPOSURE AND MAJOR DEPRESSIVE DISORDER

Introduction: Major depressive disorder (MDD) is a common multifactorial condition, with both genetic and environmental causes. Recently, several epidemiological studies have suggested an association between air pollution exposure and MDD; indeed, inhalation of air pollutants such as particulate matter (PM) may promote blood-brain barrier (BBB) disruption and neuroinflammation, possibly exacerbating MDD symptoms. Nevertheless, the biological mechanisms underlying this association remain largely uninvestigated. Extracellular vesicles (EVs) are a powerful system of intercellular communication that participates in the response to many environmental cues. EVs can cross the BBB and alter its permeability, thus modulating the bi-directional exchange of information between the brain and the periphery. Since EVs can be found in virtually all biological fluids and carry molecular components originating from parental cells, they might provide a non-invasive strategy to study alterations occurring in otherwise inaccessible organs. Of note, alterations in EV profile have been reported under many pathological conditions, including MDD. Aims of the project: to clarify the biological mechanisms linking air pollution exposure, EVs, and brain pathophysiology. To achieve this aim, the project was divided in two parts: Part 1 was carried out at the EPIGET lab (University of Milan) and aimed at investigating the complex relationship between air pollution exposure, circulating EVs released by neurons (NdEVs), and MDD severity; Part 2 was carried out at the Edinger Institute (Goethe University Frankfurt) and aimed at investigating the effect of EVs released by PM-treated cultured bronchial epithelial cells on an in vitro BBB model. Part 1, materials and methods: 93 patients with MDD were randomly selected from the population of the DeprAir study (a study specifically designed to investigate the association between air pollution and MDD). Daily exposures to air pollutants (NO2, fine PM) were estimated through a flexible chemical transport model and assigned to study participants according to their residential address. MDD severity was assessed by five different rating scales. The immunoaffinity capture protocol for the isolation of NdEVs was validated by flow cytometry and nanoparticle tracking analysis. The top miRNAs carried by NdEVs were selected by screening 754 miRNAs and analyzed by target prediction/functional annotation. Then, the expression of such miRNAs was quantified by RT-qPCR in plasma NdEVs from the study population. The collected data were used to evaluate the association between air pollution exposure and the miRNA profile of NdEVs, and between NdEV miRNAs and MDD severity. Part 2, materials and methods: human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) were treated with different concentrations of three types of fine PM (ERM-CZ110, NIST2786, and PM Como), and the effect of such treatment on viability was evaluated by MTT assay and propidium iodide staining. EVs were isolated from the culture supernatant and used to treat a BBB model of mouse brain microvascular endothelial cells (MBMECs). BBB integrity was assessed by measuring trans-endothelial electrical resistance (TEER), as well as by immunocytochemistry. Part 1, results: The efficacy of the immunocapture protocol of NdEV was higher than 90%. On average, NdEVs accounted for 4.5% of total EVs, and had a smaller size (182 nm vs 218 nm). The top-miRNAs carried by NdEVs were mainly implied in intracellular signaling, cellular responses to stress/external stimuli, immune system regulation, and cell senescence. After performing NdEV miRNA analysis on the 93 study subjects, short-term NO2 exposure was found to be associated with increased levels of 4 miRNAs (miR-1274B, miR-320, miR-720, miR-451). Instead, miR-19b was positively associated with long-term exposures to both NO2 and PM with an aerodynamic diameter ≤2.5 µm (PM2.5). Besides, 10 miRNAs were associated with at least one MDD severity scale. Among them, the brain-enriched, anti-inflammatory miR-451 was found to be negatively associated with MDD severity; similarly, the anti-apoptotic miR-19b was associated with lower MDD severity scores. Part 2, results: Different PM types were found to elicit different effects on BEAS-2B cell viability, with NIST2786 causing cell death in dose-independent manner. EVs released by BEAS-2B cells treated with 100 µg/ml NIST2786 strongly reduced the TEER of MBMEC monolayers, if compared to EVs released from untreated cells. Such PM-induced EVs also affected the spatial organization of junctional proteins implied in BBB integrity. Discussion and conclusions: Overall, this study provides novel epidemiological and molecular insights into the role of EVs in mediating the effects of air pollution exposure on the brain. The profiling of NdEV miRNAs could pave the way for the identification of novel prognostic biomarkers for MDD. Understanding the influence of PM-induced EVs on the BBB might provide new perspectives on the complex mechanisms modulating brain biology in response to peripheral environmental stimuli.

Introduzione: Il Disturbo Depressivo Maggiore (DDM) è una patologia multifattoriale diffusa, attribuibile a cause genetiche e ambientali. Di recente, numerosi studi epidemiologici hanno suggerito un’associazione tra inquinamento dell’aria e DDM; infatti, in seguito a inalazione, gli inquinanti dell’aria come il particolato atmosferico (PM) potrebbero causare neuroinfiammazione e danneggiare la barriera ematoencefalica (BEE), andando a esacerbare i sintomi del DDM. Tuttavia, i meccanismi biologici alla base di questa associazione rimangono in gran parte sconosciuti. Le vescicole extracellulari (VE) costituiscono un potente sistema di comunicazione intercellulare, coinvolto nella risposta a molti stimoli ambientali. Le VE possono attraversare la BEE e alterarne la permeabilità, modulando così lo scambio bidirezionale di informazioni tra il cervello e la periferia. Poiché le VE sono presenti pressoché in tutti i fluidi biologici e trasportano molecole derivate dalle loro cellule di origine, il loro studio potrebbe rappresentare una strategia non invasiva per indagare alterazioni in organi altrimenti inaccessibili. In particolare, alterazioni nel profilo delle VE sono state osservate in molte condizioni patologiche, tra cui il DDM. Obiettivi del progetto: esplorare i meccanismi biologici che legano l’esposizione a inquinamento atmosferico, le VE, e la fisiopatologia cerebrale. A questo scopo, il progetto è stato diviso in due parti: la prima parte è stata condotta presso il lab EPIGET (Dipartimento di Scienze Cliniche e di Comunità, Università degli Studi di Milano) e si è posta come obiettivo lo studio della complessa relazione tra inquinamento dell’aria, VE circolanti rilasciate dai neuroni (VEN), e gravità del DDM; la seconda parte è stata condotta presso l’Istituto Edinger (Università Goethe, Francoforte sul Meno) e si è posta come obiettivo l’analisi dell’effetto delle VE rilasciate da cellule epiteliali bronchiali trattate con PM su un modello in vitro di BEE. Prima parte, materiali e metodi: 93 soggetti con DDM sono stati selezionati casualmente dalla popolazione dello studio DeprAir (uno studio specificamente volto ad analizzare l’associazione tra inquinamento dell’aria e DDM). L’esposizione giornaliera a inquinanti dell’aria (NO2, PM fine) è stata stimata mediante un modello di trasporto chimico ed assegnata ai partecipanti allo studio sulla base del loro indirizzo di residenza. La gravità del DDM è stata determinata mediante cinque scale di valutazione. Il protocollo di immunocattura per l’isolamento delle VEN è stato validato mediante citofluorimetria e Nanoparticle Tracking Analysis. I miRNA più espressi nelle VEN sono stati selezionati mediante uno screening di 754 miRNA e analizzati mediante target prediction analysis e annotazione funzionale. L’espressione dei miRNA selezionati è stata quindi quantificata mediante RT-qPCR nelle VEN plasmatiche dei soggetti allo studio. I dati ottenuti sono stati utilizzati per valutare l’associazione tra l’inquinamento dell’aria e il profilo di miRNA nelle VEN, e tra i miRNA delle VEN e la gravità del DDM. Seconda parte, materiali e metodi: cellule umane di epitelio bronchiale (BEAS-2B) sono state trattate con tre tipi di PM fine (ERM-CZ110, NIST2786, e PM Como) a diverse concentrazioni, e l’effetto di questi trattamenti sulla vitalità cellulare è stato valutato mediante saggio MTT e marcatura con ioduro di propidio. Le VE sono state isolate dal surnatante delle cellule BEAS-2B e utilizzate per trattare un modello di BEE costituito da cellule endoteliali derivate dalla microvascolatura cerebrale di topo (MBMEC). L’integrità della BEE è stata valutata misurando la resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) e mediante immunocitochimica. Prima parte, risultati: l'efficacia del protocollo di immunocattura delle VEN è risultata essere superiore al 90%. In media, le VEN rappresentano il 4,5% delle VE totali e hanno dimensioni inferiori (182 nm, contro 218 nm delle VE totali). I miRNA contenuti nelle VEN sono principalmente implicati nella segnalazione intracellulare, nella risposta cellulare allo stress/stimoli esterni, nella regolazione del sistema immunitario e nella senescenza cellulare. Dopo aver condotto l'analisi dei miRNA sui 93 soggetti allo studio, l'esposizione a NO2 a breve termine è risultata associata ad un aumento dei livelli di 4 miRNA (miR-1274B, miR-320, miR-720, miR-451). Inoltre, miR-19b è risultato essere associato positivamente sia all’esposizione a lungo termine di NO2, che di PM con diametro aerodinamico ≤2,5 µm (PM2,5). Inoltre, 10 miRNA sono risultati associati ad almeno una scala di gravità del DDM. Tra questi, miR-451 – un miRNA antinfiammatorio particolarmente espresso a livello cerebrale – è risultato associato negativamente alla gravità del DDM; allo stesso modo, miR-19b, con funzione anti-apoptotica, è stato associato a una minore gravità del DDM. Seconda parte, risultati: tipi diversi di PM hanno un impatto differente sulla vitalità delle cellule BEAS-2B; in particolare, NIST2786 sembra causare la morte cellulare in modo dose-indipendente. Le VE rilasciate dalle cellule BEAS-2B trattate con 100 µg/ml di NIST2786 compromettono fortemente la TEER delle MBMEC in monostrato, rispetto alle VE rilasciate da cellule non trattate. Le VE rilasciate in seguito a trattamento con PM comportano anche una riorganizzazione spaziale delle proteine giunzionali deputate al mantenimento dell'integrità della BEE. Discussione e conclusioni: nel complesso, questo studio contribuisce a fare luce sul ruolo delle VE nel mediare gli effetti dell’inquinamento atmosferico sul cervello. L’analisi dei miRNA contenuti nelle VEN potrebbe promuovere l'identificazione di nuovi biomarcatori prognostici per il DDM. Inoltre, comprendere l’effetto sulla BEE dato dalle VE rilasciate in seguito a esposizione a inquinamento potrebbe fornire nuove prospettive sui complessi meccanismi che modulano la biologia cerebrale in risposta a stimoli ambientali.