Generation and characterization of a novel transgenic line expressing human alpha-synuclein in the zebrafish nervous system as a new complementary model of Parkinson's Disease

Parkinson's Disease (PD) is the most common neurodegenerative disorder with motor symptoms worldwide. The main neuropathological features of PD are the loss of dopaminergic neurons in the nigrostriatal system and the presence of Lewy bodies (LBs) and Lewy neurites (LNs), insoluble protein inclusions composed primarily of fibrillar aggregates of α-synuclein (αSyn). Post-mortem analyses of the brains of patients with PD and dementia with Lewy bodies (DLB) have shown that the amount of αSyn deposits in synaptic aggregates is much higher than that contained in LBs, while experimental evidence from LB diseases suggests that αSyn first damages neuronal terminals, triggering retrograde degeneration leading to cell death. Recent studies have shown that the synaptic protein Synapsin III (Syn III) binds to αSyn aggregates and is significantly increased in the post-mortem brains of patients with sporadic PD and DLB. Therefore, models that replicate the pathological interaction between αSyn and Syn III could be crucial for studying the molecular basis of these diseases. In recent years, zebrafish (Danio rerio) has emerged as a useful model for studying the molecular mechanisms of neurological disorders, including PD. However, none of the transgenic zebrafish models for αSyn developed so far fully replicate all the main pathological features of PD. The aim of my thesis project was to create a transgenic zebrafish model that recapitulates the co-pathology of Syn III and αSyn, to investigate the mechanisms underlying their interaction and to improve our understanding of the pathophysiology of PD. In particular, my goal was to generate two stable transgenic zebrafish lines expressing the two proteins in the nervous system: one expressing human Syn III with a C-terminal GFP tag, and the other with expression of full-length human αSyn with an N-terminal mCherry tag. I first established the transgenic line for human Syn III. The human Syn III genomic cassette was designed to express a fusion protein consisting of human Syn IIIa and GFP at the N-terminus, driven by endogenous neuronal elavl3/HuC promoter, using the Tol2 transgenesis system. Due to the high sequence and functional homology between zebrafish Syn III and its human orthologue, the expression of the fusion protein was only possible in a transient form, as it caused high mortality and morphological abnormalities in embryos within two days of fertilization. In parallel, it was instead possible to generate a stable transgenic zebrafish line for human αSyn with an N-terminal mCherry tag. This line, Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA), shows the expression of human αSyn with the N-terminal mCherry tag under the control of the endogenous pan-neuronal elavl3/HuC promoter. Embryos at the five-day post-fertilization stage already present several phenotypic features typical of PD, such as accumulation of aggregated αSyn, decrease in catecholaminergic terminals, deficits in basal motility, and signs of anxiety. These changes were accompanied by the accumulation of endogenous Synapsin III and Synapsin II, as well as dysfunctions of autophagic flux. Studies on adult Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA) specimens have shown behavioural alterations with anxiety and a marked reduction in motor capacity compared to not αSyn-expressing controls. Overall, these results suggest that the Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA) line represents an innovative and complementary model for studying the biological basis of PD and the first stable zebrafish model expressing human αSyn that recapitulates the main features of PD from the larval stage.

La Malattia di Parkinson (MP) è il disordine neurodegenerativo a sintomatologia motoria più diffuso al mondo. Le principali caratteristiche neuropatologiche della MP sono la perdita di neuroni dopaminergici nel sistema nigrostriatale e la presenza di corpi di Lewy (CL) e neuriti di Lewy (NL), inclusioni proteiche insolubili composte principalmente da aggregati fibrillari di α-sinucleina (αSyn). Analisi post-mortem sul cervello dei pazienti affetti da MP e demenza con CL (DCL) hanno mostrato che la quantità di depositi di αSyn negli aggregati sinaptici è molto più alta rispetto a quella contenuta nei CL, mentre evidenze sperimentali di malattie a CL suggeriscono che αSyn danneggi prima i terminali neuronali, innescando una degenerazione retrograda fino alla morte cellulare. Recenti studi hanno mostrato che Synapsina III (Syn III) si lega agli aggregati di αSyn e aumenta significativamente nei cervelli post-mortem di pazienti con MP sporadica e DCL. Pertanto, modelli che replichino l'interazione patologica tra αSyn e Syn III potrebbero essere cruciali per studiare le basi molecolari di queste malattie. Negli ultimi anni, zebrafish (Danio rerio) è emerso come modello utile per studiare i meccanismi molecolari dei disturbi neurologici, inclusa la MP. Tuttavia, nessuno dei modelli zebrafish transgenici per αSyn sviluppati finora replica completamente tutte le principali caratteristiche patologiche della MP. L'obiettivo del mio progetto di tesi è stato creare un modello transgenico di zebrafish che ricapitoli la co-patologia di Syn III e αSyn, per investigare i meccanismi alla base la loro interazione e migliorare la nostra comprensione della fisiopatologia della MP. In particolare, il mio obiettivo è stato generare due linee transgeniche stabili di zebrafish che esprimessero nel sistema nervoso le due proteine: una esprimente Syn III umana con un tag GFP C-terminale, e l'altra con espressione di αSyn umana full-length con un tag mCherry N-terminale. Ho prima stabilito la linea transgenica per Syn III umana. La cassetta genomica di Syn III umana è stata progettata per esprimere una proteina di fusione costituita da Syn IIIa e GFP all’N-terminale, sotto il controllo del promotore neuronale endogeno elavl3/HuC, utilizzando il sistema di transgenesi Tol2. A causa dell'elevata omologia di sequenza e funzione tra la Syn III di zebrafish e il suo omologo umano, l'espressione della proteina di fusione è stata possibile solo in forma transitoria, in quanto ha causato un'elevata mortalità e anomalie morfologiche negli embrioni entro due giorni dalla fecondazione. In parallelo, è stata invece possibile la generazione di una linea stabile di zebrafish transgenica per αSyn umana con tag mCherry all’estremità N-terminale. Questa linea, definita Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA), mostra l’espressione di αSyn umana con il tag mCherry N-terminale sotto il controllo del promotore endogeno pan-neuronale elavl3/HuC. Gli embrioni allo stadio di cinque giorni dopo la fecondazione presentano già diverse caratteristiche fenotipiche tipiche della MP, come accumulo di αSyn aggregata, diminuzione dei terminali catecolaminergici, deficit nella motilità di base e segni di ansia. Questi cambiamenti sono stati accompagnati dall'accumulo di Synapsina III e Synapsina II, nonché da disfunzioni dei processi autofagici. Gli studi sugli esemplari adulti Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA), hanno dimostrato alterazioni comportamentali con ansia e una marcata riduzione della capacità motoria rispetto ai controlli non esprimenti αSyn umana. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che la linea Tg(elavl3:mCherry-hsa.SNCA) rappresenta un modello innovativo e complementare per studiare la base biologica della MP e il primo modello stabile di zebrafish che esprime αSyn umana che ricapitola le principali caratteristiche della MP dallo stadio larvale.