Nuove strategie farmacologiche per il trattamento dei tumori ipofisari: studi in vitro di nuovi agonisti per i recettori di dopamina e somatostatina

Durante il ciclo di dottorato, ho avuto la possibilità di collaborare a diversi lavori incentrati sullo studio dei tumori ipofisari. In particolar modo, nel 2022 è stato pubblicato il lavoro:”P720R USP8 Mutation Is Associated with a Better Responsiveness to Pasireotide in ACTH-Secreting PitNETs”, (Cancers, 2022 doi: 10.3390/cancers14102455) basato sullo studio delle mutazioni somatiche riscontrate nel gene della peptidasi ubiquitina specifica 8 (USP8). Queste mutazioni sono state associate a maggiori livelli di espressione del recettore della somatostatina sottotipo 5 (SSTR5) nei tumori neuroendocrini ipofisari (PitNET) secernenti l’ormone adrenocorticotropo (ACTH), suggerendo una correlazione tra lo stato mutazionale di USP8 e la risposta favorevole al pasireotide, il ligando multirecettore della somatostatina che agisce in particolare su SSTR5. In questo lavoro abbiamo indagato l'impatto delle mutazioni USP8 sulla responsività al pasireotide in cellule tumorali corticotrope umane e murine. Nelle cellule tumorali primarie wild-type per USP8 e trasfettate con il mutante USP8 S718del è stata osservato un aumento dell’espressione di SSTR5. Tuttavia, la trasfezione dei mutanti USP8 S718del e USP8-C40 in cellule wild-type sensibili all’azione del pasireotide sopprime la risposta al farmaco; d’altra parte, la trasfezione degli stessi mutanti in colture refrattarie al trattamento con pasireotide non influisce sulla sensibilità all’agonista di SSTR5. Il pasireotide non è riuscito a ridurre la secrezione di ACTH nelle cellule primarie di un tumore con mutazione S718P di USP8, ma ha esercitato un forte effetto anti-secretorio nelle cellule primarie provenienti da un tumore mutato per P718P. In accordo con quanto riscontrato nelle colture primarie, la trasfezione delle cellule AtT-20 con mutanti USP8 ha portato a un aumento dell'espressione di SSTR5, ma il pasireotide è stato in grado di ridurre la produzione di ACTH e l'espressione della ciclina E solo nelle cellule che overesprimevano il mutante P720R. Inoltre, il saggio di In situ Proximity Ligation e gli esperimenti di immunofluorescenza condotti sulla linea cellulare AtT-20 hanno rivelato che il mutante P720R è ancora in grado di legare le proteine di controllo 14-3-3, senza influenzare la localizzazione di SSTR5. In conclusione, la mutazione P720R USP8 potrebbe essere considerata un fattore prognostico di risposta favorevole al pasireotide nelle cellule tumorali corticotrofe. Concluso il lavoro incentrato sui tumori ACTH-secernenti abbiamo iniziato a studiare un gruppo di tumori ipofisari ad oggi orfani di terapie mediche, ovvero i tumori neuroendocrini ipofisari non secernenti (NF-PitNET), nei quali i farmaci approvati per gli altri tipi di PitNET, ad esempio gli analoghi della somatostatina (SSA) o della dopamina (DA) sono poco efficaci. Gli eventi molecolari alla base dell'efficacia variabile degli agonisti del recettore della dopamina di tipo 2 (DRD2) nei PitNET non sono noti. Oltre alla via canonica indotta dall'accoppiamento del DRD2 con le proteine Gi, la via della β-arrestina 2 contribuisce agli effetti antimitotici dati dall’attivazione del DRD2 nei PitNET prolattino(PRL)-secernenti e nei NF. Una strategia farmacologica promettente è l'uso di agonisti selettivi di DRD2 che attivino solo una di queste due vie. Lo scopo del lavoro è stato quello di confrontare gli effetti di due ligandi di DRD2, che attivano selettivamente la via della proteina G (MLS1547) o dell'arrestina 2 (UNC9994), comparandoli all'agonista di DRD2 cabergolina (CAB) il quale attiva entrambi i pathways. Lo studio è stato condotto sia in colture primarie derivanti da tumori PRL- e NF-PitNET, che nella linea cellulare MMQ, una linea ipofisaria di ratto secernente PRL. Nelle cellule MMQ, UNC9994 ha ridotto la proliferazione cellulare con un'efficacia maggiore rispetto alla CAB (-40.2 ± 20,4% vs. -21 ± 10,9%, p < 0,05), mentre l'agonista selettivo per le proteine G ha indotto solo una lieve riduzione. Inoltre, il silenziamento della β-arrestina 2, ha annullato gli effetti antiproliferativi di UNC9994 e della CAB al contrario di quanto avvenuto dopo il trattamento con la tossina della pertosse, responsabile dell’inibizione delle proteine G. In una coltura primaria di PRL-PitNET resistente al trattamento in vitro con CAB, UNC9994 è stato in grado di inibire la proliferazione cellulare e il rilascio di PRL. Al contrario, nelle colture primarie dei NF-PitNET (n = 23), gli agonisti selettivi non hanno mostrato effetti antiproliferativi migliori della CAB. In conclusione, l'attivazione preferenziale della via della β-arrestina 2 da parte di UNC9994 migliora gli effetti antiproliferativi mediati da DRD2 nei PRL-PitNET, suggerendo un nuovo approccio farmacologico per i tumori resistenti o scarsamente responsivi al trattamento con la CAB. Il lavoro è stato pubblicato nel 2023 con il titolo: ”A β-Arrestin 2-Biased Dopamine Receptor Type 2 (DRD2) Agonist Is More Efficacious Than Cabergoline in Reducing Cell Proliferation in PRL-Secreting but Not in Non-Functioning Pituitary Tumor Cells”. (Di Muro at al. Cancers, 2023 doi: 10.3390/cancers15123218.) Lo studio di nuovi possibili approcci farmacologici per i NF-Pit è proseguito con uno studio focalizzato sul recettore della somatostatina di tipo 3 (SSTR3). ITF2984 è un ligando che riconosce tutti i recettori della somatostatina (SSTR) con elevata affinità per SSTR3, in grado di indurre l'internalizzazione e la fosforilazione dell’SSTR3, di innescare il signaling delle proteine G in vitro e di esercitare attività antitumorale nel modello di ratto MENX. Poiché gli NF-PitNET esprimono alti livelli di SSTR3, lo scopo dello studio è stato quello di testare gli effetti antiproliferativi e proapoptotici di ITF2984 in colture di cellule primarie di NF-PitNET derivate da tumori umani rimossi chirurgicamente e di caratterizzarne il profilo di espressione degli SSTR. Le colture primarie derivate da 23 NF-PitNET sono state trattate con ITF2984, octreotide (OCT)(SSA con elevata affinità per SSTR2), pasireotide (PAS)(SSA con elevata affinità per SSTR2) o CAB (agonista DRD2) e sono state testate la proliferazione cellulare (mediante saggio di incorporazione di BrdU) e l'apoptosi (mediante saggio di attività della caspasi 3/7). L'espressione di SSTR3, SSTR2 e SSTR5 nei tessuti tumorali è stata analizzata mediante qRT-PCR e western blot. I nostri risultati hanno dimostrato che ITF2984 ha ridotto la proliferazione cellulare (-40,8 (17,08) %, p<0,001 rispetto al basale, n=19 NF-PitNET) e aumentato l'apoptosi cellulare (+41,4 (22,1) %, p<0,001 rispetto al basale, n=17 NF-PitNET). Al contrario, negli stessi tumori non è stato osservato alcun effetto dopo il trattamento con OCT, PAS o CAB. L'analisi dell'espressione dei recettori ha rivelato che i trascritti di SSTR3, SSTR2 e SSTR5 erano espressi a livelli simili nei tessuti tumorali ed è stata riscontrata una correlazione positiva tra i livelli proteici di SSTR3 e SSTR5. I livelli di espressione di SSTR3 non erano correlati all'inibizione della proliferazione cellulare né all'aumento dell'apoptosi dopo il trattamento con ITF2984. In conclusione, i nostri dati supportano un possibile utilizzo di ITF2984 nel trattamento farmacologico degli NF-PitNET. Lo studio è in fase di sottomissione alla rivista “Cancers”.