FORENSIC TOXICOLOGY IN UNCONVENTIONAL BIOLOGICAL MATRICES: THEEMERGING ARCHAEOTOXICOLOGICAL FIELD APPLIED TO BONE REMAINS ANDBRAIN TISSUE IN ANCIENT POPULATIONS

Forensic toxicology is a specialized branch of toxicology that plays a critical role in forensic science by detecting and interpreting the presence of exogenous substances within biological matrices for medico-legal purposes. The field involves both qualitative and quantitative analyses, where qualitative analysis confirms the presence of specific molecules, and quantitative analysis assesses their concentrations to determine their possible role in forensic cases. For example, the concentration of a drug might be evaluated to ascertain if it contributed to a lethal intoxication. Forensic toxicological analyses traditionally rely on conventional biological matrices, such as blood, urine, and visceral samples. However, these matrices may not always be available, especially in cases involving advanced decomposition or skeletonization. In such situations, forensic toxicologists focus onto unconventional matrices, which include bones, nails, hair, teeth, and in certain cases even paraffin-embedded tissues and fabric remains. Moreover, as one of the most durable biological matrices, bones can retain molecules of toxicological interest long after other tissues have decomposed. This characteristic makes bone tissue an invaluable resource in cases where skeletal remains are the only materials available for analyses. Despite its potential, bone toxicology is less studied and understood compared to other matrices, with significant challenges in both extraction techniques and data interpretation. However, even if the extraordinary potential of the bone matrix is known, limited information is available in the literature on the use of unconventional biological matrices such as bone tissue. Similarly, less is known about how to prepare the bone tissue and how to extract and interpret the xenobiotics that can be extrapolated from the bone matrix. To overcome the lack of information regarding the bone matrix, the primary aim of this Ph.D. project was focused on the detection of analytes of toxicological interest in both forensic and archaeological human skeletal remains trying to find a proper and efficient bone extraction procedure to maximize the toxicological investigation and data interpretation. After the maximization of the extraction power of a method, bone toxicology was sided by bone microscopy to better understand how and how much the molecules can remain entrapped inside the bone tissue and what can influence their detection in this substrate. Thus, a secondary objective of the project was to evaluate if the microstructural changes or microtaphonomic influences (i.e., the processes affecting remains post-mortem) might affect the toxicological results with the aim to further interpret the toxicological results yet maximized by a new and effective extraction technique. Thus, as forensic toxicology continues to evolve (with new extraction techniques and bone matrix interpretation) and its integration with other disciplines, such as forensic anthropology, it promises to enhance our ability to reconstruct the lives and identities of individuals from skeletal remains, whether in contemporary forensic cases or historical contexts. Moreover, the emerging field of archaeotoxicology further broadens the scope of forensic toxicology, applying its techniques to ancient remains to uncover historical medical practices and social habits. The Ca’ Granda project, the third aim of this project, exemplifies the potential of this interdisciplinary approach, offering a window into the lives of the Milanese individuals of the Modern Age (1600s) and underscoring the importance of forensic toxicology in both contemporary and historical investigations. Finally, the fourth and last objective was to expand the traditional biological profile of skeletonized individuals that can be reconstructed with anthropological investigation integrating the toxicological profile of a subject. Indeed, forensic anthropology traditionally focuses on reconstructing a biological profile based on four basic descriptors: sex, age-at-death, ancestry, and stature. However, advances in empirical and technological methods now allow for a much more detailed reconstruction of life experiences and health of the subjects under investigation from skeletal remains. By incorporating forensic toxicology and the analysis of bone diseases and lesions, forensic anthropology can expand beyond the traditional biological profile to what is now being termed the "biocultural profile". This approach includes not just basic biological data, but also insights into the individual's health, habits, and lifestyle, further aiding in the identification process.

La tossicologia forense è una branca specializzata della tossicologia che svolge un ruolo cruciale nelle scienze forensi, rilevando e interpretando la presenza di sostanze esogene all'interno di matrici biologiche a fini medico-legali. La tossicologia forense include analisi sia qualitative che quantitative: le prime confermano la presenza di molecole, mentre le seconde ne valutano le concentrazioni per determinare il loro possibile ruolo e le implicazioni nei casi forensi. Ad esempio, la concentrazione di un farmaco può essere valutata per accertare se questo abbia contribuito a un'intossicazione letale. Le analisi tossicologiche forensi si basano tradizionalmente su matrici biologiche convenzionali, come sangue, urina e campioni viscerali. Tuttavia, queste matrici possono non essere sempre disponibili, soprattutto in caso di avanzata decomposizione e completa scheletrizzazione. In tali situazioni, i tossicologi forensi si concentrano su matrici non convenzionali, che includono ossa, unghie, capelli, denti e, in alcuni casi, anche tessuti e resti inclusi in paraffina. Le ossa, essendo una delle matrici biologiche più durevoli, possono trattenere le molecole di interesse tossicologico per un lungo periodo, anche dopo la decomposizione di altri tessuti. Questa caratteristica rende il tessuto osseo una risorsa inestimabile nei casi in cui i resti scheletrici siano l’unica matrice disponibile per le analisi. Nonostante il potenziale, la tossicologia forense applicata su osso è meno studiata e compresa rispetto alla sua applicazione su altre matrici, presentando sfide significative sia nelle tecniche di estrazione che nell'interpretazione dei dati. Sebbene il potenziale della matrice ossea sia noto, le informazioni disponibili in letteratura sull'uso di matrici biologiche non convenzionali, come il tessuto osseo, sono limitate. Analogamente, si sa poco su come preparare il tessuto osseo e su come estrarre e interpretare gli xenobiotici presenti in esso. Per colmare questa lacuna, l'obiettivo principale di questo progetto di dottorato si è concentrato sulla rilevazione di analiti di interesse tossicologico in resti scheletrici umani, sia forensi che archeologici, cercando di sviluppare una procedura di estrazione ossea efficiente per massimizzare l'indagine tossicologica e l'interpretazione dei dati. Dopo aver ottimizzato il metodo di estrazione, la tossicologia su osso è stata affiancata dalla microscopia per comprendere meglio come e in che misura le molecole possano rimanere intrappolate nel tessuto osseo e quali fattori possano influenzarne la rilevazione. Pertanto, un obiettivo secondario del progetto è stato valutare se i cambiamenti microstrutturali o le influenze microtafonomiche (ossia i processi che interessano i resti post-mortem) potessero influenzare i risultati tossicologici, con l'intento di perfezionare ulteriormente l'interpretazione dei dati ottenuti grazie a nuove ed efficaci tecniche di estrazione. Con la continua evoluzione della tossicologia forense (grazie a nuove tecniche di estrazione e interpretazione della matrice ossea) e la sua integrazione con altre discipline, come l'antropologia forense, si promette di migliorare la nostra capacità di ricostruire la vita e l'identità degli individui a partire dai resti scheletrici, sia in contesti forensi contemporanei che storici. Inoltre, il campo emergente dell'archeotossicologia amplia ulteriormente l'applicazione della tossicologia forense, permettendo di indagare pratiche mediche e abitudini sociali del passato attraverso resti antichi. Il progetto Ca' Granda, terzo obiettivo di questo progetto, esemplifica il potenziale di questo approccio interdisciplinare, offrendo una finestra sulla vita degli individui milanesi dell'età moderna (1600) e sottolineando l'importanza della tossicologia forense nelle indagini contemporanee e storiche. Infine, il quarto e ultimo obiettivo è stato ampliare il tradizionale concetto di profilo biologico degli individui scheletrizzati, ricostruito attraverso l'indagine antropologica, integrandolo con il profilo tossicologico. L'antropologia forense si concentra solitamente sulla ricostruzione di un profilo biologico basato su quattro descrittori fondamentali: sesso, età alla morte, origine biogeografica e statura. Tuttavia, i progressi nei metodi empirici e tecnologici permettono oggi di ricostruire in modo molto più dettagliato le esperienze di vita e lo stato di salute dei soggetti studiati a partire dai resti scheletrici. Incorporando, quindi, la tossicologia forense e l'analisi delle malattie e delle lesioni ossee, l'antropologia forense può espandersi oltre il tradizionale profilo biologico, verso il concetto di "profilo bioculturale". Questo approccio include non solo dati biologici di base, ma anche informazioni sulla salute, le abitudini e lo stile di vita dell'individuo, contribuendo ulteriormente al processo di identificazione.