EXPLORING THE EXTRACELLULAR VESICLE-NANOSTRUCTURED SECRETOME INTERFACE TOWARD CLINICAL TRANSLATION

Extracellular Vesicles (EVs), as biogenic nanoparticles, hold great potential for disease diagnosis and treatment due to their biocompatibility, ability to transport bioactive molecules, and capacity for targeted delivery. However, their clinical translation faces challenges related to their physicochemical properties, interfacial phenomena, and dynamic interactions within biological fluids that alter their biological identity and function. Thus, this PhD thesis investigates the interface between EVs and nanostructured secretomes, aiming to advance precision medicine by bridging experimental findings with clinical applications. Furthermore, this thesis provides new insights into EV-interface phenomena and EV applications such as drug delivery systems, advancing state-of-the-art with new original concepts and techniques. Specifically, Chapter 1 provides a comprehensive overview of EVs in nanomedicine, outlining their applications in diagnostics, drug delivery, and therapy, while also discussing current limitations in their clinical application. Chapter 2 explores the EV-nanostructured secretome interface, focusing on the formation of the biomolecular corona (BC) on the EV surface and its implications for EV identity, function, and biodistribution. In Chapter 3, the study investigates the effect of protein physisorption during EV surface functionalization with targeting antibodies, emphasizing the importance of controlling all steps in the functionalization process, as protein adsorption can significantly affect the efficacy of EV-based therapies. Chapter 4 presents a novel fluorescence correlation spectroscopy (FCS)-based approach to study BC dynamic formation on two distinct EV subpopulations in physiological conditions, providing insights into how EV composition and surface properties influence their biological behavior. Chapter 5 examines the interactions between EVs and lipoproteins (HDL, LDL, VLDL) using fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS). The results reveal distinct interaction patterns, which may be biologically relevant due to the role of EV-lipoprotein aggregates in pathological conditions, such as cancer metastasis. Finally, Chapter 6 details the development of a multimodal EV-based drug delivery (nano)platform for triple-negative breast cancer (TNBC). By engineering EVs to carry cetuximab and cisplatin, this approach enhances drug delivery efficiency, reduces chemoresistance, and activates cell-death pathways such as ferroptosis, offering a promising solution for TNBC treatment. Overall, this thesis presents significant advancements in understanding the interfacial phenomena of EVs and their application in therapeutic delivery systems. The results provide a solid foundation for future studies which may finally lead to clinical translation of EV-based therapies, particularly in the context of precision medicine, and open up new avenues for the development of targeted treatments for challenging diseases such as TNBC.

Le vescicole extracellulari (EVs), in quanto nanoparticelle biogeniche, offrono un grande potenziale diagnostico e terapeutico grazie alla loro biocompatibilità, alla capacità di trasportare molecole bioattive e alla possibilità di fornire un rilascio mirato di farmaci. Tuttavia, la loro traslazione clinica incontra sfide legate alle loro proprietà chimico-fisiche, ai fenomeni interfacciali e alle loro interazioni dinamiche nei fluidi biologici, che alterano la loro identità biologica e funzione. Pertanto, questa tesi di dottorato ha avuto l’obiettivo di studiare le interazioni all’interfaccia tra le EVs e il secretoma nanostrutturato, con l'intento di favorire la traslazione delle EV in medicina di precisione colmando il divario tra i risultati sperimentali e l’applicazione clinica. Questa tesi fornisce nuovi dati ed evidenze sui fenomeni di interfaccia delle EVs e sulle loro applicazioni come sistemi di rilascio di farmaci, introducendo nuovi concetti e tecniche originali. Nello specifico, il Capitolo 1 offre una panoramica completa delle EVs nella nanomedicina, delineando le loro applicazioni nella diagnostica, nel rilascio di farmaci e nelle terapie, evidenziando al contempo le attuali limitazioni per la loro applicazione clinica. Il Capitolo 2 introduce i fenomeni all'interfaccia tra EVs e secretoma nanostrutturato, concentrandosi sulla formazione della corona biomolecolare (BC) e le sue implicazioni sull'identità, la funzione e la biodistribuzione delle EVs. Nel Capitolo 3, lo studio indaga l'effetto del fisisorbimento di proteine durante la funzionalizzazione superficiale delle EVs con anticorpi, sottolineando l'importanza di controllare tutte le fasi del processo, poiché questo adsorbimento può andare ad influenzare significativamente l'efficacia del targeting per cui la formulazione di EVs è stata progettata. Il Capitolo 4 presenta un approccio innovativo basato sulla spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) per studiare la dinamica di formazione della BC su due diverse sottopopolazioni di EVs in condizioni fisiologiche, fornendo nuovi dati su come la composizione e le proprietà superficiali delle EVs influenzano il loro comportamento biologico. Nel Capitolo 5, vengono esaminate le interazioni tra EVs e lipoproteine (HDL, LDL, VLDL) utilizzando la spettroscopia di correlazione incrociata di fluorescenza (FCCS). I risultati rivelano modelli di interazione distinti, potenzialmente rilevanti dal punto di vista biologico a causa del ruolo degli aggregati EV-lipoproteine in condizioni patologiche come, per esempio, la metastasi tumorale. Infine, il Capitolo 6 descrive lo sviluppo di una piattaforma multimodale per il rilascio di farmaci basata su EVs, mirata al trattamento del carcinoma mammario triplo negativo (TNBC). Ingegnerizzando le EVs per trasportare cetuximab e cisplatino, questo approccio migliora l'efficienza del rilascio dei farmaci, riduce la chemioresistenza e attiva meccanismi di morte cellulare come la ferroptosi, offrendo una promettente soluzione per il trattamento del TNBC. Complessivamente, questa tesi rappresenta un avanzamento significativo nella comprensione dei fenomeni interfacciali delle EVs e delle loro applicazioni nei sistemi di trasporto di farmaci. I risultati forniscono una solida base per studi futuri che potrebbero portare alla traslazione clinica di terapie basate su EVs, specialmente nel contesto della medicina di precisione, aprendo nuove strade per lo sviluppo di farmaci nanotecnologici specifici per patologie complicate da trattare, come il TNBC.