L'inibitore del TGF-βR1 galunisertib rimodella il microambiente del PDAC limitando la polarizzazione delle cellule natural killer con fenotipo simil-deciduale

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) accounts as the leading cause of cancer-related deaths globally. Natural killer (NK) cells are innate lymphoid cells endowed with important anti-tumor abilities crucial for tumor surveillance and elimination. However, as it has been reported across various cancer types, NK cells can acquire pro-tumor phenotype/functions and can fail in recognizing and eliminating PDAC cells. Here, we characterized NK cells in PDAC patients and in a PDAC in vivo mouse model and we tested whether, pharmacologically blockade of TGF-β/TGF-βR1 axis in PDAC cells, would impact in reducing pro-tumor NK cells, while re-educating the PDAC TME. NK cells from PDAC patients, healthy controls (HC), and those from healthy controls, polarized with conditioned media (CM) from PDAC cell lines (BxPC3, MIAPaCa2, PANC-1) and PDAC carcer-related fibroblasts (CAFs), treated or not with the TGF-βR1 inhibitor Galunisertib (GAL), where characterized for the expression of decidual like markers, namely CD9 (tetraspanin) and CD49a (1-integrin), degranulation capability and production of perforin and granzyme-B, by multicolor flow cytometry. In vivo, FC119 murine PDAC cells were orthotopically injected into syngeneic C57BL/6 mice to evaluate the effects of GAL treatment on NK cell polarization and the PDAC tumor microenvironment. We observed an expansion of circulating and tissue-infiltrating CD9+ NK cells in PDAC patients, compared to HCs. CM from PDAC cell lines and CAFs increased the generation of decidual-like of CD9+ NK cells in circulating, HC-derived, NKs, simultaneously diminishing their cytotoxic capabilities. Treatment of PDAC cell lines and CAFs with GAL reduced their ability, via soluble factors (CM), to induce the anergic NK phenotype, decreasing frequency of CD9+ NK cells and restoring their degranulation and cytotoxic function. Similarly, in vivo GAL treatment led to a reduction in CD9+ NK cells, an increase in M1 macrophages, and enhanced frequency of IFNγ-producing NK and CD8+ T cells, in PDAC tumor tissues. Our findings highlight the presence of decidual-like NK cells in PDAC patients and underscore the importance of TGF-β/TGF-βR1 signaling in driving the PDAC cell line/fibroblast-mediated polarization of NK cells toward a pro-tumor, anergic phenotype. We propose GAL as a dual-targeting agent capable of both inhibiting the generation of decidual-like NK cells and restoring NK cell anti-tumor activities in PDAC.

Il carcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta una delle principali cause di morte per cancro a livello globale. Le cellule Natural Killer (NK) sono cellule linfoidi innate dotate di importanti capacità antitumorali cruciali per la sorveglianza e l'eliminazione dei tumori. Tuttavia, come riportato in vari tipi di tumore, le cellule NK possono acquisire un fenotipo/funzioni pro-tumorali e non riuscire a riconoscere ed eliminare le cellule di PDAC. In questo studio, abbiamo caratterizzato le cellule NK in pazienti con tumore pancreatico e in un modello murino di PDAC e abbiamo testato se il blocco farmacologico dell'asse TGF-β/TGF-βR1 nelle cellule di PDAC possa ridurre le cellule NK pro-tumorali, rieducando il microambiente tumorale. Le cellule NK di pazienti con PDAC, controlli sani (HC) e quelle dei controlli sani polarizzate con il mezzo condizionato (CM) da linee cellulari di PDAC (BxPC3, MIAPaCa2, PANC-1) e fibroblasti associati a tumore (CAF), trattate o meno con l’inibitore di TGF-βR1 Galunisertib (GAL), sono state caratterizzate per l’espressione di marcatori simil-deciduali, cioè CD9 (tetraspanina) e CD49a (α1-integrina), capacità di degranulazione e produzione di perforina e granzima-B tramite citometria a flusso multiparametrica. In vivo, le cellule di PDAC murine FC119 sono state iniettate ortotopicamente in topi C57BL/6 singenici per valutare gli effetti del trattamento con GAL sulla polarizzazione delle cellule NK e sul microambiente tumorale del PDAC. Abbiamo osservato un’espansione di cellule NK CD9+ circolanti e infiltranti nei tessuti nei pazienti con PDAC rispetto ai controlli sani. Il CM delle linee cellulari di PDAC e dei CAF ha aumentato la frequenza di cellule NK simil-deciduali, CD9+, in NK derivanti da HC, diminuendone contemporaneamente le capacità citotossiche. Il trattamento delle linee cellulari di PDAC e dei CAF con GAL ha ridotto la loro capacità, tramite fattori solubili, di indurre un fenotipo anergico nelle NK, diminuendo la frequenza di cellule NK CD9+ e ripristinando la loro degranulazione e funzione citotossica. Il trattamento con GAL in vivo ha portato a una riduzione delle cellule NK CD9+, a un aumento dei macrofagi M1 e a una maggiore frequenza di cellule NK e CD8+ T produttrici di IFNγ nei tessuti tumorali del PDAC. I nostri risultati evidenziano la presenza di cellule NK simil-deciduali nei pazienti con PDAC e sottolineano l'importanza dell'asse TGF-β/TGF-βR1 nell'indurre, da parte delle linee cellulari/fibroblasti di PDAC, la polarizzazione delle cellule NK verso un fenotipo pro-tumorale, anergico. Proponiamo GAL come agente a duplice azione, capace sia di inibire l'induzione di cellule NK simil-deciduali sia di ripristinare le attività antitumorali delle cellule NK nel PDAC.