ROLE OF POLO KINASE CDC5 IN DNA DAMAGE PROCESSING AND REPAIR PATHWAY CHOICE.

Polo-Like Kinases (PLKs) are master regulators of cell cycle in all eukaryotes, and they have also been implicated in the maintenance of genomic stability. Importantly, cell cycle progression is known to affect DSB repair pathway choice and efficiency, but molecular details of these regulations are still mostly unknown. In this thesis, I report the novel characterization of Cdc5, the only PLK in budding yeast, in DSB repair pathways. To this aim, I employed the hypomorphic cdc5-T238A allele in yeast strains which repair a single HO-DSB through specific pathways. The data collected demonstrate that Cdc5 kinase activity is fundamental in promoting Break-Induced Replication (BIR), a detrimental Homologous Recombination subpathway in which a migrating replication bubble elongates a persistent D-loop for tens of kilobases. In particular, cdc5-T238A cells display defective BIR initiation, as they fail to start DNA synthesis from the D-loop. Consistently, cdc5-T238A allele displays reduced Rad51-ssDNA presence at the invading locus, but is proficient in loading Rad51 on ssDNA. The results obtained also exclude the BIR defect to be caused by deregulated resection or impaired DNA damage adaptation in cdc5-T238A mutants. Deletion of Srs2 helicase/translocase completely suppresses cdc5-T238A defect in D-loop extension and double deletion of Srs2 and the Rad51 cofactor Rad55 eliminates the need of a functional CDC5 allele in BIR. Finally, I report the novel identification of Two-Hybrid interactions between Cdc5 and Rad51, Rad55, Rdh54 and Srs2, critical factors in presynaptic filament maturation and D-loop metabolism. In conclusion, this thesis expands the knowledge on PLKs role in DNA repair. Notably, PLKs are commonly deregulated in many tumours and their inhibition is object of study in cancer therapy. The discovery of Cdc5 involvement in BIR proposes a link between PLKs deregulation and BIR-related chromosomal rearrangements observed in cancer cells. Finally, as part of a side project, I exploited Srs2 separation-of-function mutants to investigate Srs2 involvement at different steps of BIR.

Le Polo-chinasi (Polo-Like Kinases; PLK) sono regolatori del ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e sono state implicate nel mantenimento della stabilità genomica. La scelta ed efficienza dei meccanismi di riparazione del DNA dipendono dalla progressione nel ciclo cellulare, ma i meccanismi molecolari di questa regolazione sono ancora poco noti. Questa tesi riporta la caratterizzazione del ruolo di Cdc5, unica PLK in S. cerevisiae, nella riparazione di Double-Strand Breaks (DSBs). Per questo studio ho introdotto l’allele ipomorfico cdc5-T238A in ceppi in grado di riparare DSBs tramite meccanismi di riparazione unici. I dati raccolti dimostrano che l’attività chinasica di Cdc5 è fondamentale nella via Break-Induced Replication (BIR), una via di ricombinazione omologa in cui una bolla replicativa migrante estende un intermedio D-loop per migliaia di kilobasi. Mutanti cdc5-T238A mostrano un difetto iniziale di BIR, poiché non riescono ad avviare la sintesi del DNA dal D-loop. L’allele cdc5-T238A mostra anche una ridotta presenza del filamento Rad51-ssDNA al sito di invasione, ma è competente a reclutare Rad51 sul DNA a singolo filamento. I risultati escludono che il difetto di BIR sia dovuto a una resezione del danno alterata o a un problema di adattamento al danno nei mutanti cdc5-T238A. La delezione della elicasi/traslocasi Srs2 sopprime completamente il difetto della mutazione cdc5-T238A nell'estensione del D-loop e la delezione simultanea di Srs2 e Rad55, cofattore di Rad51, rimuove la necessità di un allele CDC5 funzionale in BIR. Infine, riporto la prima identificazione di interazioni per Doppio Ibrido tra Cdc5 e Rad51, Rad55, Rdh54 e Srs2, fattori critici nella maturazione dei filamenti presinaptici e nel metabolismo del D-loop. In conclusione, questa tesi amplia la conoscenza del ruolo delle Polo-chinasi nella riparazione del DNA. Queste chinasi sono comunemente deregolate in molti tipi tumorali e la loro inibizione è oggetto di studio nella terapia antitumorale. La scoperta del coinvolgimento di Cdc5 nella via di BIR propone un collegamento tra la deregolazione delle PLKs e i riarrangiamenti cromosomici dovuti a BIR osservati in cellule tumorali. Infine, come parte di un progetto collaterale, ho impiegato mutanti separatori di funzione di Srs2 per studiare il suo coinvolgimento in diverse fasi della BIR.