Frataxin silencing alters microtubule stability in motor neurons: implications for Friedreich’s ataxia

To elucidate the pathogenesis of axonopathy in Friedreich’s Ataxia (FA), a neurodegenerative disease characterized by axonal retraction, we analyzed the microtubule (MT) dynamics in an in vitro frataxin-silenced neuronal model (shFxn). A typical feature of MTs is their “dynamic instability”, by which they undergo phases of growth (polymerization) and shrinkage (depolymerization). MTs play a fundamental role in the physiology of neurons and every perturbation of their dynamicity is highly detrimental for neuronal functions. The aim of this study is to determine whether MTs are S-glutathionylated in shFxn and if the glutathionylation triggers MT dysfunction. We hypothesize that oxidative stress, determined by high GSSG levels, induces axonal retraction by interfering with MT dynamics. We propose a mechanism of the axonopathy in FA where GSSG overload and MT depolymerization are strictly interconnected. Indeed, using a frataxin-silenced neuronal model we show a significant reduction of neurites extension, a shift of tubulin toward the soluble fraction and a consistent increase of glutathione bound to the cytoskeleton. The live cell imaging approach further reveals a significant decrease in MT growth lifetime due to frataxin silencing, which is consistent with the MT destabilization. The in vitro antioxidant treatments trigger the axonal regrowth and the increase in stable MTs in shFxn, thus contributing to identify new neuronal targets of oxidation in this disease and providing a novel approach for antioxidant therapies.

Per poter delineare i meccanismi patogenetici che sottendono l’assonopatia nell’Atassia di Friedreich (FA), una malattia neurodegenerativa caratterizzata da retrazione assonale, abbiamo analizzato la dinamica dei microtubuli (MTs) in un modello neuronale in vitro silenziato per il gene della fratassina (shFxn). Una caratteristica tipica dei MTs è la loro "instabilità dinamica", attraverso cui vanno incontro a fasi di crescita (polimerizzazione) e catastrofe (depolimerizzazione). I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale nella fisiologia dei neuroni e ogni perturbazione della loro dinamicità è fortemente penalizzante per le funzioni neuronali. Lo scopo di questo studio è stato quello di determinare se i microtubuli sono S-glutationilati nella linea shFxn e se la glutationilazione potesse innescare disfunzioni a carico dei microtubuli stessi. La nostra ipotesi è che lo stress ossidativo, determinato da elevati livelli di GSSG, induca la retrazione assonale interferendo con la dinamica dei microtubuli. Il modello neuronale silenziato per la fratassina, da noi sviluppato, mostra una significativa riduzione dell'estensione dei neuriti, uno spostamento del rapporto tubulina solubile/depolimerizzata a favore della frazione solubile e un consistente aumento del glutatione legato al citoscheletro. L'approccio in vivo di imaging rivela inoltre una significativa diminuzione della crescita dei microtubuli dovuta al silenziamento della fratassina, in accordo con la destabilizzazione a cui i microtubuli vanno incontro. I trattamenti antiossidanti in vitro, inoltre, innescano la ricrescita assonale e promuovono la percentuale di microtubuli stabili nella linea shFxn, contribuendo così ad identificare nuovi target neuronali di ossidazione in questa malattia e fornendo un nuovo approccio per le terapie antiossidanti.