Approcci multipli per investigare la variabilità nella biodisponibilità e nel metabolismo dei (poli)fenoli

Increasing evidence suggests that modest, long-term intakes of (poly)phenol-rich foods can reduce the risk of chronic diseases. (Poly)phenols are the most abundant category of phytochemicals and constitute a heterogeneous family of more than 8000 molecules. Their cytoprotective activities derive from an indirect modulation of cellular signaling pathways controlling processes relevant to age-related disease progression. The main hindrance to exploiting their potential for the prevention of chronic diseases is the heterogeneity in the physiological response to their consumption, which mainly originates from inter-individual differences in their bioavailability and metabolism. An attempt to unravel metabotypes (aka metabolic phenotypes) has been made to manage this variability, based on qualitative, quantitative or quali-quantitative criteria. It is crucial to consider that the health effects attributed to (poly)phenol consumption may derive from a synergistic action exerted by the ingested (poly)phenols along the gastrointestinal tract, by their metabolites and catabolites acting systemically, and by the gut microbial ecology associated with their bioconversion. In this sense, the relationship between gut microbiota and (poly)phenols is bidirectional: gut microbiota is involved in (poly)phenol catabolism, while phenolic compounds can positively modulate the colonic microbial composition and function. The aim of this Doctoral Thesis was to investigate the variability in (poly)phenol bioavailability and metabolism by applying multiple approaches. Two distinct factors contributing to the variation in (poly)phenol bioavailability and metabolism were analyzed: endogenous/host-related factors, including genetic background and gut microbiota, and chemical/structural properties, namely the native compound structure. Four different approaches were applied to achieve this objective: (1) an in vitro study using a human fermentation model, (2) an acute human intervention study, (3) a chronic human intervention study, (4) a systematic review of human studies. The first three approaches are based on targeted metabolomics analyses, while the fourth is based on a critical literature review. In the first study, a protocol of in vitro colonic fermentation was optimized using pure flavan-3-ol compounds with a different structure ((−)-epicatechin and procyanidin dimers B2 and A2). The protocol optimization was achieved by extending the incubation time and monitoring fermentation conditions. The analysis of pH and faecal microbiota composition confirmed the stability and the colon-like features of the incubation environment, while the extension of the fermentation time until 48 h and the monitoring of 5 different incubation times allowed to quantify additional low molecular weight catabolites. Results suggest that the flavan-3-ol structure influences microbial catabolism from a quantitative, qualitative and kinetic point of view: flavan-3-ol polymerization and the addition of an ether linkage in A-type procyanidins increase the steric hindrance and stiffness of the molecule, with a reduction in bioaccessibility resulting in delayed and reduced catabolism. The impact of the flavan-3-ol structure on the production of phenolic metabolites was further investigated in an acute, cross-over intervention trial. Different plant extracts rich in flavan-3-ols were consumed by healthy subjects: a green tea extract, a grape seed extract with high monomeric content, and a grape seed extract with high procyanidin content. Three chemical/structural properties were considered: polymerization, B-ring hydroxylation extent, and presence of galloyl moieties. The contribution of endogenous metabolites (mainly low molecular weight phenolics) to the pool of urinary flavan-3-ol metabolites was evaluated to avoid biases in the bioavailability estimates. Differences between treatments in the 24 h and 48 h urinary excretion of phenolic metabolites were assessed, indicating that the native flavan-3-ol structure influences the bioavailability and metabolism of this (poly)phenol class. Results confirmed that procyanidins are resistant to microbial catabolism, while the peculiar composition of green tea flavan-3-ols results in the richest metabolic profile. The third study consisted of the analysis of plasma and spot urine samples from a 12-week, placebo-controlled parallel intervention trial. The intervention involved the intake of freeze-dried cranberry powder in healthy older adults. Cranberry consumption led to changes in plasma metabolites but did not influence the urinary phenolic profile. A metabotyping approach was applied to handle inter-individual variability in (poly)phenol metabolism in free-living conditions. Three phenolic metabotypes characterized by quali-quantitative differences in the urinary excretion of some gut microbial metabolites were identified and further confirmed when applying a model focused only on flavan-3-ol colonic metabolites. Results suggest that colonic metabolism is the main driver for subject clustering, and flavan-3-ol metabolites may be key in determining (poly)phenol metabotypes, being flavan-3-ol metabotypes highly predictive of (poly)phenol metabotypes. In the fourth study, a critical systematic review of human studies was performed to investigate the impact of genetic variations on (poly)phenol bioavailability and metabolism. In particular, the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes involved in (poly)phenol absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) and the inter-individual variability in the plasma or urinary levels of (poly)phenol metabolites was explored. A total of twelve studies were selected, investigating different (poly)phenol sources and classes: green tea flavan-3-ols, orange flavanones, soy isoflavones, flaxseed lignans, and phenolic compounds from free diet. In total, 88 SNPs in 33 genes were analyzed, more than half of which were related to drug/xenobiotic metabolism. Phase II metabolism was the most investigated, confirming the crucial role of conjugation in (poly)phenol metabolism. The metabolites influenced by genetic variability were structurally-related flavonoid metabolites, mainly phase II conjugates, and gut microbiota metabolites. There was no consensus among studies allowing to associate a particular genetic variant with a change in the levels of a specific metabolite in urine or plasma, suggesting the need for more high-quality research in the field and new methodologies such as genome-wide association studies. The findings of this Doctoral Thesis represent a starting point for improving the available knowledge on the variability in (poly)phenol bioavailability and metabolism, which is key to unveiling the health-promoting activity of phenolic metabolites associated with the consumption of (poly)phenol-rich foods. This information would help develop new concepts and methodologies and build a new scenario based on preventive, evidence-based, personalized nutrition strategies with these major dietary plant bioactives.

Crescenti evidenze scientifiche suggeriscono che consumi moderati e a lungo termine di cibi ricchi in (poli)fenoli possono ridurre il rischio di malattie croniche. I (poli)fenoli rappresentano la più grande categoria di fitocomposti e costituiscono una famiglia eterogenea di più di 8000 molecole. Le loro attività citoprotettive derivano da una modulazione indiretta di vie di segnalazione cellulare che controllano processi rilevanti per la progressione di patologie legate all’invecchiamento. Il principale ostacolo allo sfruttamento del loro potenziale per la prevenzione delle malattie croniche è l’eterogeneità nella risposta fisiologica al loro consumo, che origina principalmente da differenze interindividuali nella loro biodisponibilità e metabolismo. Un tentativo di scoprire i metabotipi (anche detti fenotipi metabolici) è stato effettuato per gestire questa variabilità, basandosi su criteri qualitativi, quantitativi o quali-quantitativi. È cruciale considerare the gli effetti sulla salute attribuiti al consumo dei (poli)fenoli possono derivare da un’azione sinergica esercitata dai (poli)fenoli ingeriti lungo il tratto gastrointestinale, dai loro metaboliti e cataboliti che agiscono in modo sistemico, e dall’ecologia microbica intestinale associata alla loro bioconversione. In questo senso, la relazione tra il microbiota intestinale e i (poli)fenoli è bidirezionale: il primo è coinvolto nel catabolismo dei (poli)fenoli, mentre questi ultimi possono modulare positivamente la composizione e la funzione microbica intestinale. Lo scopo di questa Tesi di Dottorato è stato quello di investigare la variabilità nella biodisponibilità e nel metabolismo dei (poli)fenoli applicando approcci multipli. Sono stati analizzati due diversi fattori che contribuiscono a tale variazione: fattori endogeni/dipendenti dall’ospite, inclusi l’assetto genetico e il microbiota intestinale, e proprietà chimiche/strutturali, ovvero la struttura nativa dei composti. Quattro diversi approcci sono stati applicati per raggiungere questo obiettivo: (1) uno studio in vitro usando un modello di fermentazione umano, (2) uno studio di intervento sull’uomo in acuto, (3) uno studio di intervento sull’uomo in cronico, (4) una revisione sistematica di studi sull’uomo. I primi tre approcci sono basati su analisi metabolomiche targeted, mentre il quarto è basato su una revisione critica della letteratura. Nel primo studio, un protocollo di fermentazione colonica in vitro è stato ottimizzato utilizzando composti puri di flavan-3-oli con una diversa struttura ((−)epicatechina e dimeri di procianidina B2 e A2). L’ottimizzazione del protocollo è stata ottenuta estendendo il tempo di incubazione e monitorando le condizioni di fermentazione. L’analisi del pH e della composizione del microbiota ha confermato la stabilità e le caratteristiche simil-coloniche dell’ambiente di incubazione, mentre l’estensione del tempo di fermentazione fino a 48 ore e il monitoraggio di 5 diversi tempi di incubazione hanno permesso di quantificare cataboliti addizionali a basso peso molecolare. I risultati suggeriscono che la struttura dei flavan-3-oli influenza il catabolismo microbico da un punto di vista quantitativo, qualitativo e cinetico: la polimerizzazione e l’aggiunta di un legame etere nelle procianidine di tipo A aumentano l’ingombro sterico e la rigidità della molecola, con una riduzione della bioaccessibilità, che risulta in un catabolismo rallentato e ridotto. L’impatto della struttura dei flavan-3-oli sulla produzione di metaboliti fenolici è stata ulteriormente investigata in uno studio di intervento cross-over in acuto. Diversi estratti vegetali ricchi in flavan-3-oli sono stati consumati da soggetti sani: un estratto di tè verde, un estratto di semi d’uva con un alto contenuto di monomeri, e un estratto di semi d’uva con un alto contenuto di procianidine. Tre proprietà chimiche/strutturali sono state considerate: la polimerizzazione, il grado di idrossilazione dell’anello B e la presenza di unità di gallato. È stato anche valutato il contributo dei metaboliti endogeni (principalmente composti fenolici a basso peso molecolare) al pool di metaboliti urinari dei flavan-3-oli per evitare errori nelle stime della biodisponibilità. Sono state rilevate differenze tra i trattamenti nell’escrezione urinaria dei metaboliti fenolici in 24 e 48 ore, da cui si deduce che la struttura nativa dei flavan-3-oli influenza la biodisponibilità e il metabolismo di questa classe di (poli)fenoli. I risultati confermano che le procianidine sono resistenti al catabolismo microbico, mentre la peculiare composizione dei flavan-3-oli del tè verde dà origine al profilo metabolico più ricco. Il terzo studio ha previsto l’analisi di campioni di plasma e urina provenienti da uno studio di intervento di 12 settimane, controllato e in parallelo. L’intervento è consistito nell’assunzione di polvere liofilizzata di mirtillo rosso americano da parte di soggetti anziani in salute. Il consumo di mirtillo rosso americano ha determinato cambiamenti nei metaboliti plasmatici ma non ha influenzato il profilo metabolico urinario. È stato applicato un approccio di metabotipizzazione per maneggiare la variabilità interindividuale nel metabolismo dei (poli)fenoli in condizioni non controllate. Tre metaboliti fenolici caratterizzati da differenze quali-quantitative nell’escrezione urinaria di alcuni metaboliti microbici sono stati identificati e ulteriormente confermati applicando un modello basato solo sui metaboliti colonici dei flavan-3-oli. I risultati suggeriscono che il metabolismo colonico è il principale determinante del raggruppamento dei soggetti, e i metaboliti dei flavan-3-oli possono essere cruciali nel determinare i metabotipi dei (poli)fenoli, essendo i metabotipi dei flavan-3-oli altamente predittivi dei metabotipi dei (poli)fenoli. Nel quarto studio, è stata condotta una revisione sistematica e critica di studi sull’uomo per investigare l’impatto delle variazioni genetiche sulla biodisponibilità e il metabolismo dei (poli)fenoli. In particolare, è stata esplorata l’associazione tra polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni coinvolti nell’assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) dei (poli)fenoli e la variabilità interindividuale nei livelli plasmatici o urinari dei metaboliti dei (poli)fenoli. Sono stati selezionati dodici studi che indagano diverse fonti e classi di (poli)fenoli: flavan-3-oli del tè verde, flavanoni dell’arancia, isoflavoni della soia, lignani dei semi di lino, e composti fenolici da dieta libera. In totale, sono stati analizzati 88 SNP in 33 geni, più della metà dei quali relativi al metabolismo di farmaci/xenobiotici. Il metabolismo di fase II è stato il più investigato, confermando il ruolo cruciale della coniugazione nel metabolismo dei (poli)fenoli. I metaboliti influenzati dalla variabilità genetica comprendevano metaboliti strutturalmente correlati ai flavonoidi, principalmente coniugati di fase II, e metaboliti di origine microbica. Non è stato trovato alcun consenso tra gli studi che ha permesso di associare una particolare variante genetica ad un cambiamento nei livelli di un metabolita specifico nelle urine o nel plasma, suggerendo il bisogno di ricerca di maggiore qualità nel campo e di nuove metodologie come studi di associazione genome-wide. I risultati di questa Tesi di Dottorato rappresentano un punto di partenza per migliorare la conoscenza disponibile sulla variabilità nella biodisponibilità e nel metabolismo dei (poli)fenoli, che rappresenta un fattore chiave per svelare l’attività protettiva dei metaboliti fenolici associata al consumo di cibi ricchi in (poli)fenoli. Questa informazione aiuterà nello sviluppo di nuovi concetti e metodologie e nella costruzione di un nuovo scenario basato su strategie nutrizionali preventive, basate sull’evidenza e personalizzate con questi importanti composti bioattivi vegetali.