Strategie innovative per il trattamento non invasivo dei tumori cutanei non-melanoma

Methotrexate (MTX), a known anti-metabolite of folic acid (FA), has given promising results against keratoacanthoma and specified cases of squamous cell carcinoma, upon intralesional injection (off-label). However, this is a painful and invasive procedure and shows adverse effects due to systemic absorption. The aim of the project was to develop innovative formulations for the topical administration of MTX in a non-invasive or minimally invasive way, to treat more efficaciously non melanoma skin cancers, improving topical bioavailability and reducing transdermal absorption. Given MTX toxicity, FA was selected as a model drug due to the similarities in the physicochemical properties and in vitro skin behavior. To support the skin retention and permeation data obtained in in vitro permeation experiments, two-photon microscopy technique was used as an innovative tool for drug visualization in the tissue, based on its fluorescence properties. The images obtained suggest a preferential drug retention in hair follicles, which is worth further investigation. The next step of the research was to test the effect of a minimally invasive approach based on the use of microneedle roller to improve FA skin retention: in particular the effect of the number of passes and of the needle length was evaluated. The effect of the application time was considered as well. Four passes of microneedle roller equipped with 0.5 mm long microneedles guaranteed to maximize drug retention and minimize drug permeation through the skin, after the application of a solution for 6 hours. Since the application of a solution is not suitable for clinical treatment, different topical formulations were developed and tested in vitro in passive condition or after pretreatment with microneedle roller. Topical films composed by hydrophilic polymers (polyvinyl alcohol-PVA and polyvinylpyrrolidone- PVP) were developed, but the results of skin retention were not satisfactory. The attention then moved to semisolid formulations, like hydrogels and emulsions: PVA- and PVP-based hydrogels were developed, but the results were not optimal compared to those obtained with drug solution. The use of biphasic systems gave better results: in particular, a o/w emulsion containing Tefose® applied after pretreatment with microneedle roller, guaranteed a retention of drug over than 35 µg/cm2, much higher than the reference solution, without increasing significantly the amount permeated. The final attempt was to include FA nanosuspension in soluble microneedles, but the amount retained in the skin was lower compared to application of the emulsion on pre-treated skin. Finally, the best performing formulation (Tefose® o/w emulsion) was prepared also with the active ingredient methotrexate: the results obtained were comparable for the two drugs, confirming that all the data produced with folic acid can be reasonably extended to methotrexate. The general conclusion of this work is that the topical administration of methotrexate, to be used as an alternative of intradermal injection, can be realized by combining a traditional formulation (such as an emulsion) with a minimally invasive technique, such as skin pretreatment with microneedles.

Il metotressato (MTX), un noto antimetabolita dell’acido folico (AF), ha dato risultati promettenti contro il Cheratoacantoma e specifici casi di Carcinoma a Cellule Squamose, previa iniezione intralesionale (off-label). Tuttavia, questa è una procedura dolorosa e invasiva, non priva di effetti avversi dovuti all’assorbimento sistemico. Lo scopo del progetto è stato quello di sviluppare formulazioni innovative per la somministrazione topica di MTX in modo non invasivo o minimamente invasivo, per trattare in modo più efficace i tumori cutanei di tipo non-melanoma, migliorando la biodisponibilità topica e riducendo l’assorbimento transdermico. Data la tossicità della polvere di MTX, l’AF è stato selezionato come farmaco modello grazie alle somiglianze nelle proprietà chimico-fisiche e nel comportamento in vitro in seguito ad applicazione topica. Per supportare i dati sulla ritenzione cutanea e sulla permeazione ottenuti negli esperimenti di permeazione in vitro, è stata utilizzata la tecnica della microscopia a due fotoni come strumento innovativo per la visualizzazione del farmaco nel tessuto, in base alle sue proprietà di fluorescenza. Le immagini ottenute suggeriscono una ritenzione preferenziale del farmaco nei follicoli piliferi; ulteriori indagini saranno necessarie per confermare questo comportamento. Il passo successivo della ricerca è stato quello di testare l’effetto di un approccio minimamente invasivo basato sull’uso di microaghi montati su un rullo (comunemente chiamati dermaroller) per migliorare la ritenzione cutanea dell’AF: in particolare è stato valutato l’effetto del numero di passaggi e della lunghezza degli aghi. È stato considerato anche l’effetto del tempo di applicazione. Quattro passaggi con il dermaroller da 0,5 mm garantiscono la massima ritenzione del farmaco e la minimizzazione della sua permeazione attraverso la pelle, dopo l’applicazione di una soluzione per 6 ore. Poiché l’applicazione di una soluzione non è adatta al trattamento clinico, sono state sviluppate e testate in vitro diverse formulazioni topiche, sia in assenza che dopo pretrattamento con dermaroller. Sono stati sviluppati film topici composti principalmente da polimeri idrofili (alcol polivinilico-PVA- e polivinilpirrolidone-PVP), ma i risultati sulla ritenzione cutanea non sono stati soddisfacenti. L’attenzione si è poi spostata verso formulazioni semisolide, come idrogeli ed emulsioni: sono stati sviluppati idrogeli a base di PVA e PVP, ma i risultati non sono stati ottimali se rapportati a quelli ottenuti con la soluzione del farmaco. L’utilizzo di sistemi bifasici ha dato i risultati migliori: in particolare, un’emulsione o/w contenente Tefose®, applicata dopo pretrattamento con dermaroller, ha garantito una ritenzione di farmaco superiore a 35 µg/cm2, molto maggiore della soluzione di riferimento, senza aumentarne significativamente la quantità permeata. Il tentativo finale è stato quello di includere una nanosospensione di AF nei microaghi solubili, ma dopo test in vitro la quantità trattenuta nella pelle è risultata inferiore rispetto a quella ottenuta dopo applicazione dell’emulsione sulla pelle pretrattata. Infine, la formulazione che ha fornito i risultati migliori (emulsione o/w contenente Tefose®) è stata preparata anche con il principio attivo metotressato: i risultati ottenuti sono risultati comparabili per i due farmaci, confermando che tutti i dati ottenuti con l’acido folico possono essere ragionevolmente estesi al metotressato. La conclusione generale di questo lavoro è che la somministrazione topica di metotressato, da utilizzare come alternativa all’iniezione intradermica, può essere realizzata combinando una formulazione tradizionale (come un’emulsione) con una tecnica minimamente invasiva, come il pretrattamento cutaneo con microaghi.