Disfunzioni del metabolismo mitocondriale del ferro: trattamenti innovativi per l'anemia sideroblastica causata dalla mutazione di SLC25A38 e per l'Atassia di Friedreich.

Mitochondria are the site of important biological functions such as cellular respiration and energy production. Less known but equally important is their role in the metabolism of trace elements like iron. Due to its property of exchanging electrons, iron is involved in a multitude of processes related to metabolism, growth, and cellular respiration. The metabolism of this metal must be tightly regulated as its alterations are associated with excessive production of radical species and oxidative stress, leading to dramatic consequences on cell viability. The alteration of iron metabolism represents the common denominator of the two topics addressed in this thesis, which are Congenital Sideroblastic Anemia due to mutations of the mitochondrial carrier SLC25A38 and Friedreich's Ataxia. This thesis discusses a form of congenital sideroblastic anemia (CSA) caused by mutations in the SLC25A38 carrier, a mitochondrial protein involved in heme synthesis. Unlike the more common CSA form, A38-CSA is resistant to pyridoxine treatment. To provide a reliable biological model, two cell lines were selected and characterized. The first is the commercial erythroleukemic K562 line, which underwent CRISPR/Cas9 gene editing to silence the SLC25A38 gene. The resulting clone was renamed A38-low. The second is a lymphoblastoid cell line obtained from a patient with microcytic anemia, paternal isodisomy, and homozygous recessive for a mutation at the SLC25A38 locus. Both cell lines showed reduced heme production and defective respiration, but only the first model line exhibited iron accumulation, radical species, and sensitivity to oxidative stress, which are characteristic of CSA. An important part of the study aimed to develop effective therapies. Pyridoxine did not improve heme levels, but treatment with pyridoxal 5'-phosphate (PLP) significantly restored heme levels and respiratory function. PLP’s effects were linked to its role as an antagonist of P2 purinergic receptors, which influence various biological processes. Similar effects were observed with other P2 receptor antagonists, suggesting that PLP and related compounds could offer potential treatment for this form of anemia. Friedreich’s Ataxia (FRDA) is the most common hereditary ataxia in Europe, characterized by the progressive degeneration of sensory neurons, leading to dysfunctions in the central and peripheral nervous systems. The disease is caused by the expansion of a GAA triplet repeat in the frataxin gene (FRX), which is involved in iron-sulfur cluster biogenesis and heme synthesis. This thesis extends prior research demonstrating the beneficial effects of Diazoxide (DZX), an antihypertensive drug, in cellular and mouse models of Friedreich's Ataxia (FRDA). DZX activates mitochondrial ATP-sensitive potassium channels, influencing reactive oxygen species (ROS) production, mitochondrial respiration, and neuronal survival. The major challenge in treating FRDA is overcoming the blood-brain barrier (BBB). In collaboration with Professor Denora's research group, a drug delivery system using solid lipid nanoparticles (SLN) was developed. This system successfully allowed DZX to cross the BBB more effectively than free DZX. Treatment with DZX-containing SLNs (SLN-DZX) reduced ROS levels and improved cell viability in fibroblasts from FRDA patients. These results highlight the potential of SLN-DZX as a promising therapeutic strategy to mitigate oxidative stress in FRDA.

I mitocondri sono sede di importanti funzioni biologiche come la respirazione cellulare e la produzione di energia. Meno noto ma altrettanto importante è il loro ruolo nel metabolismo di oligoelementi come il ferro. Per la sua proprietà di scambiare elettroni, il ferro risulta imputato in una moltitudine di processi che riguardano il metabolismo, la crescita e la respirazione cellulare. Il metabolismo di questo metallo deve essere strettamente controllato poiché sue alterazioni si associano ad una eccessiva produzione di specie radicaliche e stress ossidativo, con conseguenze drammatiche sulla vitalità cellulare. L’ alterazione del metabolismo del ferro rappresenta il comune denominatore dei due argomenti affrontati nel seguente lavoro di tesi e che sono l’Anemia Sideroblastica Congenita dovuta a mutazione del carrier mitocondriale SLC25A38 e l’Atassia di Friedreich. Il primo fenotipo patologico trattato in questa tesi riguarda una forma rara di anemia sideroblastica congenita (CSA) causata da mutazioni del carrier mitocondriale SLC25A38, che svolge un ruolo fondamentale nella sintesi dell’eme. A differenza della forma più comune di CSA, A38-CSA è resistente al trattamento con piridossina. Con l’obiettivo di fornire un modello biologico affidabile, sono state selezionata e caratterizzate due linee cellulari. La prima è la linea commerciale eritroleucemica K562 su cui è stata applicata la tecnica di editing genetico CRISPR/CAS9, con il fine di silenziare il gene SLC25A38. Il clone ottenuto e difettivo per il carrier è stato rinominato A38-low. La seconda utilizzata è una linea linfoblastoide ottenuta da un paziente affetto da anemia microcitica, isodisomia paterna e omozigote recessivo per una mutazione nel locus SLC25A38. Entrambe le linee presentano riduzione di eme e difetto respiratorio, ma solo la linea A38-low mostra accumulo di ferro, specie radicaliche e sensibilità allo stress ossidativo, caratteristiche della CSA. Per sviluppare una strategia terapeutica, è stato testato il trattamento con piridossina, che non ha portato benefici, mentre il trattamento con 5-piridossal fosfato (PLP) ha favorito il recupero di eme e della respirazione nelle linee cellulari A38-low e A38-CSA. Si ipotizza che gli effetti positivi siano legati all'azione di PLP come antagonista dei recettori purinergici P2, suggerendo un possibile uso di PLP e altri antagonisti dei recettori P2 nel trattamento di questa forma di anemia. L'Atassia di Friedreich (FRDA) è la forma più comune di atassia ereditaria in Europa, caratterizzata dalla degenerazione progressiva dei neuroni sensoriali, che porta a disfunzioni del sistema nervoso centrale e periferico. La malattia è causata dall'espansione di una ripetizione tripla GAA nel gene della frataxina (FRX), che è coinvolto nella biogenesi dei cluster ferro-zolfo e nella sintesi dell’eme. Questa tesi amplia le ricerche precedenti che dimostrano gli effetti benefici del Diazossido (DZX), un farmaco antipertensivo, in modelli cellulari e murini di Atassia di Friedreich (FRDA). Il DZX attiva i canali al potassio ATP-sensibili mitocondriali, influenzando la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la respirazione mitocondriale e la sopravvivenza neuronale. La principale sfida nel trattamento della FRDA è superare la barriera emato-encefalica (BBB). In collaborazione con il gruppo di ricerca del Professor Denora, è stato sviluppato un sistema di somministrazione del farmaco utilizzando nanoparticelle lipidiche solide (SLN). Questo sistema ha permesso al DZX di attraversare la BBB in modo più efficace rispetto al DZX libero. Il trattamento con SLN contenenti DZX (SLN-DZX) ha ridotto i livelli di ROS e migliorato la viabilità cellulare nei fibroblasti da pazienti con FRDA. Questi risultati evidenziano il potenziale delle SLN-DZX come una promettente strategia terapeutica per mitigare lo stress ossidativo nella FRDA.