Kidney in a box: sviluppo di un modello renale in vitro per lo studio delle ciliopatie

Kidney epithelial cells possess an intrinsic ability to sense and respond to mechanical and chemical cues within the tubular environment, a function essential for maintaining fluid and electrolyte homeostasis. While traditionally attributed to plasma membrane proteins such as ion channels and transporters, recent evidence highlights the pivotal role of intracellular organelles as key signaling hubs in this process. This thesis investigates organelle-specific signaling mechanisms in renal epithelial cells, with a focus on lysosomal calcium signaling and primary cilia-mediated β-adrenergic signaling. Our findings reveal that lysosomal Ca²⁺ release via TRPML1 induces sustained cytosolic Ca²⁺ oscillations through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (Ins3PRs) on the endoplasmic reticulum. This signaling cascade modulates cytoskeletal organization, activates calcineurin/NFAT signaling, and promotes the apical accumulation of the water channel AQP2—critical for water reabsorption in the collecting duct. Additionally, we demonstrate that primary cilia serve as mechanosensors in β-adrenergic signaling, with β2-adrenergic receptors (β2ARs) localized to the cilium playing a predominant role in regulating cytosolic cAMP levels. However, our results indicate that ciliary β-adrenergic signaling is primarily dependent on cytosolic cAMP rather than direct signal generation within the cilium itself. A key challenge in studying these intricate signaling pathways is the absence of physiologically relevant in vitro models that replicate the kidney’s dynamic microenvironment. To address this, we employed the LiveBox2 bioreactor, which simulates fluid shear stress conditions experienced in vivo. Our results show that dynamic culture within this system enhances epithelial integrity, modulates tight junction protein composition, and reorganizes the actin cytoskeleton, thereby facilitating AQP2 trafficking to the apical membrane. By integrating advanced molecular biology techniques with innovative bioreactor technology, this work provides new insights into the role of intracellular organelles in renal epithelial signaling. These findings advance our understanding of kidney function and open new avenues for therapeutic strategies targeting kidney disease.

Le cellule epiteliali renali possiedono un'innata capacità di percepire e rispondere a segnali meccanici e chimici presenti nell'ambiente tubulare, una funzione essenziale per il mantenimento dell'omeostasi dei fluidi e degli elettroliti. Sebbene tradizionalmente attribuita a proteine di membrana plasmatica, come canali ionici e trasportatori, evidenze recenti evidenziano il ruolo fondamentale degli organelli intracellulari come centri di segnalazione in questo processo. Questa tesi indaga i meccanismi di segnalazione specifici degli organelli nelle cellule epiteliali renali, con particolare attenzione al segnale calcio-mediato dai lisosomi e alla segnalazione β-adrenergica mediata dalle ciglia primarie. I nostri risultati mostrano che il rilascio di Ca²⁺ dai lisosomi tramite TRPML1 induce oscillazioni prolungate del Ca²⁺ citosolico attraverso i recettori inositolo 1,4,5-trifosfato (Ins3PRs) situati sul reticolo endoplasmatico. Questa cascata di segnalazione modula l'organizzazione del citoscheletro, attiva la segnalazione calcineurina/NFAT e promuove l’accumulo apicale del canale dell'acqua AQP2, essenziale per il riassorbimento dell'acqua nel dotto collettore. Inoltre, dimostriamo che le ciglia primarie fungono da hub di segnalazione β-adrenergica, con i recettori β2-adrenergici (β2ARs) localizzati sulla cilia che giocano un ruolo predominante nella regolazione dei livelli di cAMP citosolico. Tuttavia, i nostri risultati indicano che la segnalazione β-adrenergica ciliare dipende principalmente dal pool di cAMP citosolico, piuttosto che dalla generazione diretta di segnali all'interno della cilia stessa. Una delle principali difficoltà nello studio di questi complessi percorsi di segnalazione è l'assenza di modelli in vitro fisiologicamente rilevanti che riproducano il microambiente dinamico del rene. Per superare questo ostacolo, abbiamo utilizzato il bioreattore LiveBox2, in grado di simulare le condizioni di stress da flusso di fluidi che le cellule sperimentano in vivo. I nostri risultati dimostrano che la coltura dinamica all'interno di questo sistema migliora l'integrità epiteliale, modula la composizione delle proteine delle giunzioni strette e riorganizza il citoscheletro di actina, facilitando così il traffico di AQP2 verso la membrana apicale. Integrando tecniche avanzate di biologia molecolare con tecnologie innovative basate su bioreattori, questo lavoro fornisce nuove intuizioni sul ruolo degli organelli intracellulari nella segnalazione epiteliale renale. Questi risultati ampliano la nostra comprensione della fisiologia renale e aprono nuove prospettive per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate alle patologie renali.