Molecular insights into diving ability adaptation of the Galapagos marine iguana (Amblyrhynchus cristatus)

When diving and foraging, air-breathing marine vertebrates encounter significant physiological challenges that include hypoxia during the breathing pause and oxygen storage depletion. The endemic marine iguana that is endemic to the Galapagos archipelago, Amblyrhynchus cristatus, is known worldwide for its unique adaptation to foraging in the ocean. They are able to dive to depths of up to 30 meters and can remain submerged for a duration ranging from 30 minutes to an hour. These behaviours expose A. cristatus to reduced oxygen concentration in its cells. Despite anatomical adaptations for swimming and foraging, such as flattened tails, sharp claws, and special nasal salt secreting glands, are well known and described, the molecular basis and evolutionary history of the traits associated with adaptation to a marine environment remain unknown. Therefore, in this PhD project, I utilised genome and other molecular data to investigate the molecular basis of diving adaptation of the Galapagos marine iguana. I compared the results obtained from the marine iguana genome with those obtained from three other Galapagos iguanas adapted to the terrestrial life: Conolophus marthae, C. pallidus and C. subscristatus. Hemoglobin (Hb) was selected as a candidate protein for my study because of its primary role in transporting respiratory gases and involvement in the hypoxia adjustment mechanism. From the assembled genomes, four globin subunit genes were identified in all studied species: alpha-A (αA), αD, beta-I (βI) and βII-globin gene – that consistent with other squamate reptiles. Each iguana is presumed to possess two Hb isoforms, HbA and HbD, encoded by αA and αD globin gene, respectively, which are also exhibited in birds and reptiles. With the presence of the two nonidentical β-globin genes, three Hb tetramers were predicted: (i) α2βI2, (ii) α2βII2, and (iii) α2βIβII. Furthermore, through sequence comparison, I identified five amino acid substitution positions in the Hb sequence associated with hemoglobin-oxygen affinity levels, as indicated in previous studies. Notably, in the marine iguana, four out of these five positions exhibit amino acid properties favouring higher oxygen affinity, while only a single position in the βIsubunit has been found to possess amino acid properties associated with low oxygen affinity. Additionally, I conducted molecular dynamics (MD) simulations to assess the structural stability of each predicted Hb tetramers. The simulation revealed that tetramer α2βII2 in the marine iguana demonstrated a prolonged simulation time in high oxygen affinity state (relaxed, R) compared to other iguanas, suggesting that this tetramer is potentially the most expressed tetramer in the marine iguana as part of its hypoxia adaptation. In conclusion, this PhD results provide valuable insight into molecular level interactions allowing for specific Hb mediated diving adaptations. The findings contribute to a deeper understanding of the evolution of diving and marine foraging behaviours in the marine iguana, offering a foundation for further research in this field.

Quando si immergono e cercano cibo, i vertebrati marini che respirano aria affrontano significativi problemi fisiologici che includono l'ipossia durante la pausa respiratoria e il depauperamento delle riserve di ossigeno. L’iguana marina endemica delle isole Galapagos, Amblyrhynchus cristatus, è conosciuta in tutto il mondo per la sua particolare capacità di cercare cibo nell'oceano. Queste iguane sono in grado di tuffarsi a profondità fino a 30 metri e possono rimanere sott'acqua per un periodo che varia da 30 minuti a un'ora. Questi comportamenti espongono A. cristatus a una ridotta concentrazione di ossigeno nelle cellule. Nonostante gli adattamenti anatomici per nuotare e cercare cibo, come code appiattite, artigli affilati e ghiandole nasali specializzate per secernere il sale, siano ben noti e descritti, la base molecolare e la storia evolutiva dei tratti associati all'adattamento all'ambiente marino rimangono sconosciute. Pertanto, in questo progetto di dottorato, ho utilizzato dati genomici e molecolari per investigare la base molecolare dell'adattamento all’immersione dell’ iguana marina delle Galapagos. Ho confrontato i miei dati con quelli ottenuti da altre tre iguane delle Galapagos adattate alla terraferma: Conolophus marthae, C. pallidus e C. subscristatus. Quelli per l’emoglobina (Hb) sono stati selezionata come geni candidati per il mio studio a causa del suo ruolo principale di questa molecola nel trasporto dei gas respiratori e del suocoinvolgimento nel meccanismo di adattamento all'ipossia. Dai genomi assemblati, sono stati identificati quattro geni delle subunità globiniche in tutte le specie studiate: alfa-A (αA), αD, beta-I (βI) e il gene della globina βII, che è consistente con altri rettili squamati. Si presume che ogni iguana possieda due isoforme di Hb, HbA e HbD, codificate rispettivamente dai geni delle globine αA e αD, che sono presenti anche negli uccelli e nei rettili. Con la presenza dei due geni della β-globina non identici, sono stati previsti tre tetrameri di Hb: (i) α2βI2, (ii) α2βII2 e(iii) α2βIβII. Inoltre, attraverso il confronto delle sequenze, ho identificato cinque posizioni di sostituzione degli aminoacidi nella sequenza di Hb associate ai livelli di affinità dell'emoglobina per l'ossigeno, come indicato in studi precedenti. Notevolmente, nella iguana marina, quattro di queste cinque posizioni mostrano proprietà degli aminoacidi che favoriscono un'affinità più elevata con l'ossigeno, mentre solo una posizione nella subunità βI è stata trovata con proprietà degli aminoacidi associate a un'affinità bassa con l'ossigeno. Inoltre, ho condotto simulazioni di dinamica molecolare (MD) per valutare la stabilità strutturale di ciascun tetramero di Hb previsto. La simulazione ha rivelato che il tetramero α2βII2 nella iguana marina ha mostrato un prolungato tempo di simulazione in uno stato di elevata affinità con l'ossigeno (rilassato, R) rispetto ad altre iguane, suggerendo che questo tetramero sia potenzialmente il tetramero più espresso nella iguana marina come parte del suo adattamento all'ipossia. In conclusione, i risultati di questo dottorato forniscono preziose informazioni sulle interazioni a livello molecolare che permettono specifici adattamenti al tuffo mediati dall'Hb. Le scoperte contribuiscono a una comprensione più approfondita dell'evoluzione dei comportamenti di tuffo e di ricerca alimentare marina nella iguana marina, offrendo una base per ulteriori ricerche in questo campo.