Unravelling the role of the mitochondrial protein C1QBP in mammalian adaptation to environmental stressors

Environmental stressors are factors that challenge individuals, compelling them to adjust their behaviour or physiology in order to cope. Adaptation to environmental stressors results in alterations in morphology, physiology, or behaviour, ultimately enhancing the survival and reproductive success of the organism or group of organisms. Consequently, they exert a significant impact on the evolutionary and ecological processes that shape species evolution. Mitochondria play a critical role in the adaptation to environmental stressors in eukaryotes, such as low oxygen availability, nutrient fluctuations, and temperature shifts. This is due to their remarkable ability to rapidly adjust to the metabolic needs of the cell. As the powerhouse of the cell, mitochondria are central to essential processes including ATP production, intracellular Ca2+ regulation, reactive oxygen species (ROS) production and scavenging, and the regulation of apoptotic cell death. For example, in endotherms, mitochondria are crucial for cold adaptation through non-shivering thermogenesis, primarily in brown adipose tissue (BAT), but also in skeletal muscle. It has recently been shown that cells respond to environmental stressors also by releasing extracellular vesicles (EVs) that carry various biomolecules, such as nucleic acids, proteins, and lipids. These acts as mediators of environmental and metabolic stress. Several studies have demonstrated that external stressors not only alter the secretion of EVs but also their composition, thereby influencing the mediating function of these vesicles. Thus, EVs can be potent mediators of environmental stimuli. The overall goal of my PhD project was to identify new factors in mitochondria that contribute to the adaptation to environmental stressors, particularly cold stress, in mammals. Mammals respond to cold exposure by non-shivering thermogenesis (NTS) in BAT and skeletal muscle as well as shivering thermogenesis (ST) in skeletal muscle. We demonstrated that after cold exposure, brown adipocytes release EVs enriched with damaged mitochondrial proteins. Among the proteins upregulated in BAT EVs exposed to cold, we focused our attention on the mitochondrial protein C1QBP, a marker of BAT, even though its function is not yet known. We investigated the possible role of C1QBP in cold adaptation using in vitro and animal models (M. musculus). The results obtained in adipose cells indicated that C1QBP expression increases during adipocyte differentiation (adipogenesis) and following thermogenic stimulation, and it accumulates in mitochondria of brown adipocytes under both basal and stressful conditions. This supports a possible role of this protein in thermogenesis. Subsequently, we analysed the mRNA and protein expression of C1QBP and other mitochondrial proteins in fat depots and skeletal muscle of mice exposed to cold. An upregulation of C1QBP expression was observed in adipose depots, but not in skeletal muscle of cold-exposed mice, suggesting that C1QBP could be involved in cold response specifically in adipose tissue. To determine whether C1QBP plays a role not only in the response to cold stress but also to other types of stress, we analysed its expression in response to other stressors, particularly a high-fat diet (HFD), in both BAT and skeletal muscle. The results showed an upregulation of C1QBP expression in adipose depots, but not in skeletal muscle of HFD mice. C1QBP is an evolutionarily conserved mitochondrial protein, and homologous genes have been identified in various eukaryotes. Phylogenetic analysis revealed that the protein sequence of C1QBP is conserved across all eukaryotes, from yeast to humans, suggesting that it may play a significant role in mitochondrial function. As C1QBP is also conserved in ectotherms, we investigated its potential function in D. rerio, commonly known as zebrafish. We specifically analysed the mRNA expression of C1QBP in skeletal muscle and heart of zebrafish subjected to cold temperatures. In contrast to mammals, while some genes involved in the enhancement of mitochondrial oxidative activity and response to stress were upregulated by cold exposure in heart of zebrafish, no effects on C1QBP expression were observed. In conclusion, our studies have revealed that C1QBP, an evolutionarily conserved mitochondrial protein, may play a pivotal role in the mitochondrial functioning and adaptive response to environmental stressors, particularly cold stress, in mammalian adipose tissue. This role is underscored by the upregulation of C1QBP expression in response to cold exposure and HFD in BAT, but not in skeletal muscle. The conservation of C1QBP across eukaryotes, from yeast to humans, and its specific response in adipose tissue of mammals as opposed to ectotherms like zebrafish, suggest a specialized function in endothermic thermoregulation. Further research into C1QBP could provide significant insights into the molecular mechanisms of environmental adaptation and the evolutionary biology of thermogenesis.

Gli stress ambientali o stressors sono i principali fattori che obbligano gli individui a modificare i loro comportamenti e la loro fisiologia al fine di adattarsi a nuove condizioni. L'adattamento a questi stress porta ad alterazioni nella morfologia, fisiologia o comportamento, migliorando in definitiva la sopravvivenza e il successo riproduttivo dell'organismo (o del gruppo di organismi). Di conseguenza, esercitano un impatto significativo sui processi evolutivi ed ecologici che influenzano l'evoluzione delle specie. I mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell’adattamento agli stress ambientali negli eucarioti, come, ad esempio, la carenza di ossigeno, la disponibilità di nutrienti e le variazioni di temperatura. Questo è dovuto alla capacità di questi organelli di adattarsi velocemente alle necessità metaboliche della cellula. Funzionando come la centrale elettrica della cellula, i mitocondri sono parte integrante di processi essenziali, tra cui la produzione di ATP, la regolazione intracellulare del Ca2+, la produzione e l'eliminazione di specie reattive dell'ossigeno e la regolazione della morte cellulare per apoptosi. Inoltre, negli endotermi, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell’adattamento alle basse temperature prendendo parte al processo di termogenesi adattativa che avviene principalmente nel tessuto adiposo bruno (BAT, Brown Adipose Tissue), ma anche nel muscolo scheletrico. Recentemente, è stato dimostrato che le cellule rispondono agli stress ambientali anche rilasciando vescicole extracellulari (EVs, Extracellular Vesicles) contenenti varie biomolecole, inclusi acidi nucleici, proteine e lipidi, che agiscono come mediatori di stress ambientali e metabolici. Diversi studi hanno dimostrato che fattori di stress non solo alterano la secrezione di EVs, ma modificano anche la loro composizione, influenzando così la funzione di mediazione di queste vescicole. Pertanto, le EVs possono essere potenti mediatori degli stress ambientali. Basandomi su queste evidenze, l’obiettivo principale del mio progetto di dottorato è stato quello di trovare nuovi mediatori mitocondriali per l'adattamento agli stress ambientali, in particolare allo stress da freddo, nei mammiferi. I mammiferi rispondono alle basse temperature attraverso il processo di termogenesi non da brivido, che avviene nel BAT e nel muscolo scheletrico, e di termogenesi da brivido nel muscolo scheletrico. In questo lavoro abbiamo dimostrato che, in seguito a esposizione al freddo, gli adipociti bruni rilasciano EVs arricchite di proteine mitocondriali danneggiate. Tra le proteine sovraespresse in tali EVs abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla proteina mitocondriale C1QBP. Sebbene C1QBP sia riconosciuta tra le proteine caratterizzanti il BAT, la sua funzione non è ancora completamente nota. Abbiamo studiato la possibile funzione di C1QBP nell’adattamento al freddo in modelli cellulari in vitro e in modelli animali (M. musculus). I risultati ottenuti nei modelli in vitro hanno dimostrato che l’espressione di C1QBP aumenta durante il differenziamento degli adipociti (adipogenesi) e in seguito a stimolazione termogenica e che la proteina si accumula nei mitocondri degli adipociti bruni sia in condizioni basali che di stress. Queste evidenze, nel complesso, indicano che C1QBP possa svolgere un ruolo chiave durante il processo di termogenesi. Successivamente, abbiamo analizzato i livelli di C1QBP e quelli di altre proteine mitocondriali, sia in termini di mRNA sia di proteina, nei depositi adiposi e nel muscolo scheletrico di topi esposti al freddo. Una sovraespressione di C1QBP e di altre proteine coinvolte nel metabolismo mitocondriale e nel processo di termogenesi è stata riscontrata nei depositi adiposi, ma non nel muscolo scheletrico di topi esposti al freddo, suggerendo che C1QBP possa essere coinvolta nella risposta al freddo specificamente nel tessuto adiposo. Per comprendere se C1QBP potesse avere un ruolo limitatamente alla risposta allo stress da freddo, abbiamo analizzato la sua espressione in risposta ad altri tipi di stress ed in particolare a una dieta ricca in grassi (HFD; High Fat Diet). I risultati ottenuti hanno dimostrato una sovraespressione di C1QBP nei depositi adiposi, ma non nel muscolo scheletrico dei topi sottoposti ad HFD. C1QBP è una proteina evolutivamente conservata e geni omologhi sono stati identificati in diversi eucarioti. L'analisi filogenetica ha rivelato che la sequenza proteica di C1QBP è conservata in tutti gli eucarioti, dal lievito all'uomo, suggerendo che questa proteina possa avere un ruolo importante nel funzionamento mitocondriale. Poiché C1QBP è conservata anche negli ectotermi, abbiamo studiato la sua possibile funzione in D. rerio, comunemente noto come pesce zebra. Più approfonditamente, abbiamo analizzato i livelli di mRNA di C1QBP nei principali tessuti coinvolti nella risposta agli stress nei pesci, come il muscolo scheletrico ed il cuore, in condizioni di bassa temperatura dell’acqua. Nel pesce zebra, non si è riscontrato alcun effetto sull'espressione di C1QBP, sebbene alcuni geni associati al potenziamento dell'attività ossidativa mitocondriale e alla risposta allo stress fossero sovraespressi dall'esposizione al freddo nel cuore. In conclusione, i nostri studi hanno rivelato che C1QBP, una proteina mitocondriale evolutivamente conservata, può svolgere un ruolo fondamentale nel funzionamento mitocondriale e nella risposta adattativa ai fattori di stress ambientale, in particolare lo stress da freddo, nel tessuto adiposo dei mammiferi. Questo ruolo è sottolineato dalla sovraregolazione dell'espressione di C1QBP in risposta all'esposizione al freddo e alle diete ad alto contenuto di grassi nel BAT, ma non nel muscolo scheletrico. La conservazione di C1QBP negli eucarioti, dal lievito all'uomo, e la sua risposta specifica nel tessuto adiposo dei mammiferi rispetto agli ectotermi come il pesce zebra, suggeriscono una funzione specializzata nella termoregolazione endotermica. Ulteriori ricerche su C1QBP potrebbero fornire informazioni significative sui meccanismi molecolari dell'adattamento ambientale e sulla biologia evolutiva della termogenesi.