Role of TAp63 in myogenesis

Myogenesis is an ordered process driven by myogenic regulatory factors (MyoD, MyoG, MRF4) culminating in the fusion of myoblasts in myotubes. p53 family members are involved in myoblasts differentiation, although the role of the specific isoforms has not been investigated. Previous experiments indicated that TAp63γ isoform is the only member of the p53 family up-regulated during in vitro myogenesis, suggesting an important function for this specific isoform during this process. As experimental models we used stable modified murine myoblasts cell lines C2C7 and C2C12 (shp63 C2C7 and doxycycline-inducible TAp63γ C2C12). Microarray analysis of shp63 C2C7 cells compared to control revealed changes in the expression of genes which codify for proteins involved in cellular proliferation and metabolic processes. We confirmed that shp63 clones had an increase in their proliferative potential, evaluated by clonogenicity assay and EdU incorporation assay, and a delay in differentiation, evaluated by WB analysis of specific differentiation markers. The same assays showed that TAp63γ overexpression is able to decrease cell proliferation. Moreover, we observed an increase in mitochondrial ROS production evaluated by citofluorimetric techniques and a decrease in oxygen consumption, revealed by Seahorse analyser. RNA sequencing and ChIP sequencing for histone modification H3K27ac, performed during C2C7 differentiation, followed by microarray analysis carried out in shp63 cells revealed also several genes (coding and non coding) modulated during in vitro myoblast differentiation. Among them, we found Igf2. Igf2 is involved in muscle development and differentiation, both in vivo and in vitro. We found that p63 binds its enhancer regions, indicating its involvement in regulating Ifg2 expression during differentiation. Interestingly, we found that the long non coding RNA, Airn, is down-regulated in absence of p63 during differentiation and its silencing led to a decrease in either mRNA and protein level of myogenic differentiation markers (MyoD and MyoG). Moreover, by luciferase activity assay, we found that p63 regulates Airn expression directly, binding specific enhancers. In summary, our data reveal a novel role for TAp63 in controlling myoblasts proliferation, energy metabolism and also differentiation through the expression of specific target protein coding genes and long non coding genes. Preliminary observations, using publicity available datasets, confirmed that TAp63 isoform is among the p53-family members the isoform more expressed in adult human normal skeletal muscle. Interestingly, a genome-wide gene expression profiling of skeletal muscle from early Duchenne muscular dystrophy (DMD) patients showed a significant reduction of the TAp63 isoform expression in the affected tissues. The latter observation indicate new possible scenario for studying TAp63 contribution to muscle degenerative pathologies.

La miogenesi è un processo ordinato guidato da fattori regolatori miogenici (MyoD, MyoG, MRF4) che culmina nella fusione di mioblasti in miotubi. I membri della famiglia p53 sono coinvolti nel differenziamento dei mioblasti, sebbene il ruolo delle isoforme specifiche non sia stato studiato. Precedenti esperimenti hanno indicato che TAp63isoform è l'unico membro della famiglia p53 sovra regolato durante la miogenesi in vitro, suggerendo una funzione importante per questa isoforma specifica durante tale processo. Come modelli sperimentali abbiamo usato linee cellulari di mioblasti murini stabili modificate C2C7 e C2C12 (shp63 C2C7 e TAp63 C2C12 inducibile da doxiciclina). L'analisi “microarray” delle cellule C2C7 shp63 rispetto al controllo ha rivelato cambiamenti nell'espressione dei geni che codificano per le proteine coinvolte nei processi cellulari di proliferazione e metabolici. Abbiamo confermato che i cloni shp63 hanno un aumento del loro potenziale proliferativo, valutato mediante dosaggio di clonogenicità e saggio di incorporazione di EdU, ed un ritardo nel differenziamento, valutato mediante l'analisi WB di specifici marcatori di differenziamento. Le stesse analisi hanno dimostrato che la sovra espressione di TAp63 è in grado di diminuire la proliferazione cellulare. Inoltre, abbiamo osservato un aumento della produzione di ROS mitocondriali valutato mediante tecniche citofluorimetriche ed una diminuzione del consumo di ossigeno, rilevata dall’analisi “seahorse”. Il sequenziamento dell'RNA ed il sequenziamento della ChIP per la modificazione dell'istone H3K27ac, eseguita durante il differenziamento della linea C2C7, alla quale ha seguito l’a analisi “microarray” in cellule shp63 ha rivelato anche diversi geni (codificanti e non codificanti) modulati durante il differenziamento dei mioblasti in vitro. Tra questi, abbiamo trovato Igf2. Igf2 è coinvolto nello sviluppo e nel differenziamento muscolare, sia in vivo che in vitro. Abbiamo scoperto che p63 lega le sue regioni enhancer, indicando il suo coinvolgimento nella regolazione dell'espressione di Ifg2 durante il differenziamento. È interessante notare che il “long nonj coding RNA” Airn, è sotto-regolato in assenza di p63 durante il differenziamento ed il suo silenziamento ha portato ad una diminuzione nell livello di mRNA e della proteina dei marcatori di differenziamento miogenici (MyoD e MyoG). Inoltre, con il saggio dell'attività luciferasica, abbiamo scoperto che p63 regola direttamente l'espressione di Airn, legando specifici potenziatori. In sintesi, i nostri dati rivelano un nuovo ruolo per TAp63 nel controllo della proliferazione di mioblasti, del metabolismo energetico e anche del differenziamento attraverso l'espressione di specifici geni codificanti per proteine bersaglio e geni non codificanti. Le osservazioni preliminari, utilizzando set di dati pubblici disponibili, hanno confermato che l'isoforma TAp63 è tra i membri della famiglia p53 la più espressa nel muscolo scheletrico sano umano adulto. È interessante notare che un profilo genico dell'intero genoma del muscolo scheletrico dei pazienti con distrofia muscolare (DMD) di Duchenne precoce, ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione dell'isoforma TAp63 nei tessuti interessati. Quest'ultima osservazione indica un nuovo possibile scenario futuro per lo studio del contributo di TAp63 alle patologie degenerative muscolari.