MODIFYING PHYLLOTAXIS IN BRASSICA SEED CROP SPECIES FOR YIELD IMPROVEMENT

In a world that is continuously growing and developing, it is crucial to enhance agricultural yields to ensure an adequate food supply for the population while minimizing environmental impact. Plant yield is influenced by a range of factors, among which inflorescence architecture and its geometrical organization, known as phyllotaxis. Despite centuries of studies, the mechanism behind phyllotactic patterning is still partially unknown, especially in non-model plant species. Furthermore, the direct impact of phyllotaxis on overall yield is not well understood. In this thesis, we started to tackle these knowledge gaps. First, we reported support to the hypothesis of a direct link between phyllotaxis and yield by describing several Arabidopsis REM mutants with a permutated phyllotaxis and an increased number of siliques on the main stem. Consequently to this result, we aimed to investigate the conservation of such a mechanism in the economically important crop Brassica napus. We identified the candidate homologous genes in rapeseed and confirmed their expression in reproductive tissues. Moreover, we demonstrated that they can influence phyllotaxis in Arabidopsis, suggesting a retained role between these two species. Protein interaction tests further suggested that some interaction between REMs themselves and the auxin pathway can be conserved. To finally prove the mechanism in rapeseed, we aimed to generate the homolog REM mutants in the species by CRISPR-Cas9 gene editing. After an in silico and experimental selection of the gRNAs, we focused on the Agrobacterium mediated transformation of rapeseed. According to our results, both the transformation protocol as well as the editing need to be optimized if we want to apply up to date molecular techniques in Brassica napus. Indeed, we detected inefficiency and high technical requirements in the transformation protocol and a low functionality of the editing machinery in transformants, the latter being reported in literature too. Optimizing such techniques can exponentially speed up basic and applied research in rapeseed and open new possibilities in crop design. Indeed, multiple mutants are very often required to get phenotypes in high redundant genomes such as the one of Brassica napus and producing them by random mutagenesis is highly time consuming. Overall, this application-driven study unveils novel genes associated with phyllotaxis and yield in the Brassicaceae family, contributing to our understanding of plant architecture and offering insights into sustainable strategies for improving crop productivity.

In un mondo in continua crescita è cruciale aumentare le rese agricole per garantire un adeguato accesso al cibo a tutta la popolazione mondiale, minimizzando l’impatto ambientale. La resa di una pianta è influenzata da molti fattori, tra cui l’architettura dell’infiorescenza e la sua organizzazione geometrica, detta fillotassi. Nonostante i secoli di studi, il meccanismo alla base della disposizione fillotattica è ancora parzialmente sconosciuto, soprattutto nelle specie che non vengono usate come modello nella ricerca. Inoltre, l’impatto della fillotassi sulla resa non è ancora chiaro. In questa tesi, ho affrontato queste domande. Per prima cosa ho raccolto dati a favore dell’ipotesi di un legame diretto tra fillotassi e resa, descrivendo svariati genotipi di Arabidopsis mutati in dei geni REM, con una fillotassi perturbata e un maggior numero di silique sull’infiorescenza primaria. A seguito di questo risultato, ho investigato la conservazione di questo meccanismo in una coltura di rilevanza economica, Brassica napus (colza). Ho identificato i candidati geni omologhi nella colza e confermato la loro espressione nei tessuti riproduttivi. In aggiunta, ho dimostrato che possono influenzare la fillotassi in Arabidopsis, risultato che suggerisce che i geni conservino il loro ruolo nelle due specie. Test di interazione proteici hanno suggerito che anche l’interazione tra i REM, e tra REM e il pathway dell’auxina possa essere in parte conservata. Per dimostrare definitivamente il ruolo dei REM nella fillotassi e resa della colza, ho cercato di generare gli omologhi mutanti REM nella specie tramite editing mediato dalla tecnologia CRISPR-Cas9. Dopo una selezione in silico e sperimentale dei gRNAs, mi sono concentrati sulla trasformazione mediata da Agrobatterio. Dai miei risultati, risultano necessarie sia un’ottimizzazione dei protocolli di trasformazione che di editing se vogliamo applicare le moderne tecnologie molecolari in Brassica napus. Infatti, nella mia esperienza i protocolli di trasformazione sono risultati inefficienti e bisognosi di consolidate capacità tecniche, e la macchina di editing nei trasformanti è risultata inefficiente (in accordo con i dati in letteratura). L’ ottimizzazione di queste tecniche potrebbe esponenzialmente velocizzare sia la ricerca di base che quella applicata nella colza e aprire nuove possibilità nel disegno razionale delle colture. Infatti, mutanti multipli sono spesso richiesti per ottenere fenotipi in genomi ridondanti come quello della colza, e ottenerli tramite mutagenesi casuale richiede molto tempo. In conclusione, questo studio applicato rivela nuovi geni associati alla fillotassi e alla resa nella famiglia delle Brassicaceae, contribuendo alla comprensione dei meccanismi alla base dell’architettura dell’infiorescenza e offrendo informazioni utili per disegnare strategie sostenibili per aumentare la produttività delle colture.