IMPACT OF KETOGENIC DIET TREATMENT IN GLUT1 DEFICIENCY SYNDROME: DISCOVERY OF MOLECULAR MECHANISMS RESPONSIBLE FOR PHENOTYPE CHANGES IN BOTH PEDIATRIC AND ADULT PATIENTS

GLUT1 deficiency syndrome (GLUT1-DS) is a rare, effectively treatable, neurometabolic disease. It is caused by loss-of function mutations in the SLC2A1 gene, encoding GLUT1 protein, which supplies glucose to the brain. A genetic defect in this transporter leads to cerebral energy deficiency, resulting in a complex spectrum of neurological symptoms, including seizures and movement disorders. Although many clinical and molecular features have been deeply studied, there are still some not completely understood aspects, including (i) clinical variability and wide spectrum of SLC2A1 variations, (ii) phenotype age-related changes, and (iii) response to ketogenic diet (KD) treatment, which are investigated in this research study through a multi-omics approach. Firstly, we explored the clinical, biochemical and molecular data of 27 pediatric patients with GLUT1-DS, identifying (1) different clinical phenotypes (from early- to late-onset), (2) 25 disease-related SLC2A1 variants of which 10 never reported before, (3) a mutational hotspots in exon 4, suggesting a vulnerable region for glucose uptake associated to clinical manifestations, and (4) strong correlations between variant types, clinical and biochemical severity patterns. Next, we analyzed the transcriptional profiles and isoform switches in GLUT1-DS patients, before and after KD, focusing on three comparisons: (a) adults versus children, both untreated; (b) children in pre- versus post-KD; and (c) responders versus non-responders to KD in GLUT1-DS children. Overall, enrichment analysis revealed a reduction in inflammatory pathways in GLUT1-DS patients who experienced clinical improvements in seizure frequency and severity, whether in response to KD or during adulthood. These processes involve type I IFN signatures, which have an impact on mitochondrial function and signaling, suggesting a specific role in GLUT1-DS pathogenesis. Supporting these suggestions, the detected lncRNAs are also related to inflammatory response, as RMRP and LINC02555, or to ketone biosynthesis and oxidative phosphorylation processes, like PAX8-AS1, for which emerges its potential regulatory role in KD response. Another significant molecular pathway contributing to mitigate clinical signs is the alternative splicing of ion channel genes, such as P2X7 receptor which is, in turn, liked to inflammasome pathway. As well as this, the methylome profiles, performed by ONT, revealed altered methylation patterns in similar genes, like GRIN3A, suggesting also in this analysis an ion channel signaling deregulation. Lastly, these novel and suggestive findings underline the complex interplay that transcriptional variations, isoform switching and methylation patterns may have in the phenotype age-dependent changes and response to KD in patients with GLUT1-DS.

La sindrome da deficit di GLUT1 (GLUT1-DS) è una rara condizione neuro-metabolica, causata da mutazioni nel gene SLC2A1, che codifica per il trasportatore del glucosio, GLUT1. La carenza di GLUT1 riduce significativamente l’apporto di glucosio al cervello, compromettendone il funzionamento e determinando un quadro clinico di epilessia farmaco-resistente e disturbi del movimento. La dieta chetogenica (KD) si è dimostrata promettente nel trattamento della GLUT1-DS, come fonte energetica alternativa al glucosio. Sebbene molti aspetti clinici e biochimici della malattia siano stati ampiamente investigati, alcune aree di ricerca restano sconosciute e/o ancora poco definite: (i) l’ampio spettro di manifestazioni cliniche e variazioni genetiche, (ii) i cambiamenti fenotipici legati all'età, e (iii) le vie molecolari interessate dalla KD. In questo lavoro di tesi, tali aspetti sono stati indagati attraverso un approccio multi-omico. Sono stati analizzati i dati clinici, biochimici e genetici di 27 pazienti pediatrici affetti dalla GLUT1-DS, identificando: (1) una notevole eterogeneità clinica, con fenotipi da precoci a tardivi; (2) 25 mutazioni nel gene SLC2A1, di cui 10 mai descritte in precedenza; (3) un hotspot mutazionale nell’esone 4, associato a specifiche manifestazioni cliniche; (4) correlazioni significative tra varianti genetiche, severità clinica e dati biochimici. È stata eseguita l’analisi del trascrittoma in pazienti con GLUT1-DS, prima e dopo il trattamento con KD, considerando tre confronti: (a) adulti versus bambini entrambi non trattati, (b) bambini in pre- versus post-KD, (c) bambini responders versus non-responders alla KD, al fine di individuare le variazioni molecolari associate al miglioramento clinico, in termini di frequenza e gravità delle crisi epilettiche sia in risposta alla KD sia durante l'età adulta. In questo contesto, l’analisi di espressione genica differenziale ha mostrato una significativa riduzione dei processi infiammatori che coinvolgono la via interferonica di tipo I con effetto sulla catena respiratoria mitocondriale. Sono stati, inoltre, identificati lncRNAs, come RMRP e LINC02555, associati alla regolazione della risposta infiammatoria. Altri lncRNAs, come PAX8-AS1, sono stati correlati alla biosintesi dei chetoni e ai processi di fosforilazione ossidativa, suggerendo un potenziale ruolo regolatorio nella risposta alla KD. L’analisi delle isoforme di splicing alternativo ha evidenziato un ulteriore meccanismo molecolare rilevante che coinvolge geni codificanti canali ionici, tra cui il recettore P2X7, strettamente connesso al gene SLC2A1 e a processi neuro-infiammatori. Questo dato è stato confermato anche dall’analisi del metiloma che mostra pattern di metilazione alterati in geni canale, come GRIN3A. I risultati di questo studio, nuovi e significativi, sottolineano la complessità della GLUT1-DS, e suggeriscono il ruolo cruciale dell’epigenetica nel modulare i cambiamenti fenotipici legati all’età e la risposta alla dieta chetogenica.