Scaffold Compositi 3D per l'Ingegneria Tissutale Ossea: dalla Caratterizzazione in vitro a quella in vivo

Advancements in bone tissue engineering (BTE) critically depend on the development of biomaterials that combine biocompatibility, structural integrity, and enhanced biological functionality. This thesis focuses on enhancing alginate/hydroxyapatite (Alg/HAp) scaffolds, promising candidates in BTE but limited by their biological inertness, insufficient osteoconduction, and inadequate mechanical properties. Building on prior studies demonstrating Alg/HAp biocompatibility, this research aimed to improve the scaffolds’ biological properties and osteoconduction through two primary modifications: fibronectin functionalisation (FN) and bioactive glass incorporation (BGMS10). These modifications aimed to enhance cell adhesion, proliferation, and osteogenic differentiation, positioning the scaffolds as viable alternatives to conventional bone grafts. Fibronectin, an extracellular matrix protein known for its cell-binding properties, was added to address alginate’s inertness. It enhanced MG-63 cell interactions and was validated through electron microscopy and biochemical assays. Enhanced cell proliferation was observed under static and dynamic conditions, underscoring fibronectin’s role in supporting cell-surface interactions and bioactivity. In parallel, BGMS10, a bioactive glass containing magnesium and strontium ions, was incorporated during scaffold preparation to stimulate bone metabolism and enhance osteoconductivity. Morphological and mechanical characterizations showed stable mechanical properties with minimal porosity reduction in BGMS10 scaffolds. Unlike 45S5 Bioglass®, BGMS10 was successfully incorporated into the scaffold’s mineral phase, achieving consistent yields. MG-63 cells exhibited improved adhesion and proliferation on BG-incorporated scaffolds compared to controls. Following these promising in vitro findings, biocompatibility and osteogenic potential were evaluated using primary mesenchymal stromal cells (BM-MSCs), adipose-derived stem cells (ASCs), and M-SOD cells, providing insights into cell colonisation, proliferation, and osteogenic differentiation. A range of analyses confirmed scaffold biocompatibility, with cluster-like cell colonisation observed after 28 days of culture. FN scaffolds particularly showed improved cell adhesion and spreading, likely due to fibronectin’s adhesive properties. Gene expression analysis revealed upregulated osteogenic markers in BG scaffolds, suggesting therapeutic ion effects in promoting bone metabolism. To extend these studies into a more complex biological system, in vivo subcutaneous implantation in nude mice was conducted to assess scaffold integration and biocompatibility. Histological analysis at 2- and 4-weeks post-implantation confirmed robust cell infiltration, early collagen deposition, and initial matrix remodelling across all scaffold types. This project highlights the potential of fibronectin-functionalised and bioactive glass-incorporated alginate-based scaffolds to promote osteogenic differentiation, support tissue regeneration, and serve as viable candidates for potential clinical applications in bone repair and tissue engineering.

Le recenti innovazioni nell'ingegneria tissutale ossea (Bone Tissue Engineering, BTE) si concentrano sullo sviluppo di biomateriali capaci di combinare biocompatibilità e integrità strutturale. Questa tesi si concentra sul miglioramento degli scaffold in alginato/idrossiapatite (Alg/HAp), candidati promettenti per la BTE, ma limitati dalla loro inerzia biologica, insufficiente osteoconduzione e proprietà meccaniche inadeguate. Basandosi su studi precedenti che hanno dimostrato la biocompatibilità degli scaffold Alg/HAp, questa ricerca mira a migliorare le proprietà biologiche e l'osteoconduzione di questi scaffold attraverso due principali modifiche: la funzionalizzazione con fibronectina (FN) e l'incorporazione di biovetro (BGMS10). Queste modifiche sono state progettate per migliorare l'adesione cellulare, la proliferazione e la differenziazione osteogenica, posizionando così gli scaffold come alternative valide agli innesti ossei convenzionali. La fibronectina, una proteina della matrice extracellulare nota per le sue proprietà di legame cellulare, è stata aggiunta per compensare l'inerzia dell'alginato. Ha migliorato le interazioni delle cellule MG-63, come confermato da analisi di microscopia elettronica e saggi biochimici. Un miglioramento della proliferazione cellulare è stato osservato sia in condizioni statiche che dinamiche, evidenziando il ruolo della fibronectina nel supportare le interazioni cellula-superficie e la bioattività degli scaffold. Parallelamente, BGMS10, un biovetro contenente ioni di magnesio e stronzio, è stato incorporato durante la preparazione degli scaffold per stimolare il metabolismo osseo e migliorare l'osteoconduzione. Le caratterizzazioni morfologiche e meccaniche hanno mostrato stabilità delle proprietà meccaniche con una riduzione minima della porosità negli scaffold BGMS10. A differenza del Biovetro® 45S5, standard di riferimento che ha ostacolato la produzione degli scaffold, BGMS10 è stato incorporato con successo nella fase minerale dello scaffold, garantendo una produzione costante. Le cellule MG-63 hanno mostrato una migliore adesione e proliferazione sugli scaffold con BG rispetto al materiale di controllo. Sulla base di questi promettenti risultati in vitro, la biocompatibilità e il potenziale osteogenico degli scaffold modificati sono stati valutati utilizzando cellule stromali mesenchimali primarie (BM-MSCs), cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASCs) e una linea cellulare stromale immortalizzata (M-SOD). Questo passaggio è stato fondamentale per valutare la capacità degli scaffold di supportare la colonizzazione e la proliferazione cellulare e per ottenere una comprensione più profonda del loro potenziale di differenziazione osteogenica. Un'ampia gamma di analisi ha confermato la biocompatibilità degli scaffold, con una colonizzazione cellulare a grappolo osservata dopo 28 giorni di coltura. In particolare, gli scaffold FN hanno mostrato un'adesione cellulare e una diffusione migliorate, attribuibili alle proprietà adesive della fibronectina. L'analisi dell'espressione genica ha rivelato una maggiore espressione dei marker osteogenici negli scaffold con biovetro, suggerendo che gli ioni terapeutici hanno un ruolo nel promuovere il metabolismo osseo. Per estendere questi studi in un sistema biologico più complesso, è stato effettuato l'impianto sottocutaneo in topi per valutare l'integrazione e la biocompatibilità degli scaffold. Le analisi istologiche hanno confermato un'infiltrazione cellulare robusta, una deposizione iniziale di collagene e il rimodellamento della matrice su tutti i tipi di scaffold. Questo progetto evidenzia il potenziale degli scaffold a base di alginato, funzionalizzati con fibronectina e arricchiti con biovetro, nel promuovere la differenziazione osteogenica, supportare la rigenerazione tissutale e fungere da candidati validi per applicazioni cliniche nell'ingegneria tissutale.