EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE DI WEST NILE VIRUS 2 IN ITALIA NELLE STAGIONI 2022 E 2023

Arboviruses have an RNA genome and are classified according to their structural characteristics and ecological criteria (transmission mode). The most represented viral families are Bunyaviridae, Flaviviridae and Togaviridae. The West Nile virus belongs to the genus Orthoflavivirus (family Flaviviridae) and is maintained in nature by an enzootic transmission cycle (endemic cycle) involving adult ornithophilic mosquitoes (Culex spp.), which are vectors, and viremic birds, which function as amplifying hosts. If a mosquito bites a subject defined as dead end (man or horse), i.e. a host that does not develop a viral load sufficient to guarantee the infection's continuation, we refer to an epidemic cycle. In terms of symptoms, infections generally have an asymptomatic course (~80%). In about 20% of cases, the infection develops into mild flu-like symptoms (fever, headache, muscle and joint pain, fatigue, nausea and sometimes skin rash), defined as West Nile fever. In about 1% of cases, the infection evolves into more severe forms, with an involvement of the central nervous system. According to phylogenetic analysis, 9 viral lineages are known, of which only L1 and L2 are pathogenic to humans. The first evidence of WNV-2 in Italy was reported in 2011 in the province of Ancona and then spread rapidly throughout the country, replacing WNV-1. From 2011 to date, lineage 2 is the most frequently identified lineage in Italy, with the highest number of reported cases. To study the molecular evolution of West Nile virus L2 in Italy in 2022 and 2023, the whole genomes of 98 isolates obtained in 2022 and 2023 from animal samples (mosquito pools and homogenates of bird organs) were characterised as part of the WNV monitoring plan active in Northern Italy. Two homemade protocols were used for amplification, which required the use of primers pools or specific primers. The amplicons were subsequently sequenced on Next Generation Sequencing platforms. The sequences obtained were combined with sequences from databases to produce a European dataset from which an Italian subset was then extracted. A Maximum Likelihood analysis was conducted on the European dataset, which estimated the virus entry in 1998 and highlighted the presence of three significant subclades, in which isolates from Greece, Austria and Italy were grouped respectively. The phylogeographical analysis conducted both on the Nextstrain platform and using Bayesian methods on the European dataset estimated an entry of WNV-2 into Europe in 2002 with the most probable location of the root being Hungary (sp=0.8), which ranks as an outgroup with respect to all the European sequences in the tree. Two significant clades detached from the Hungarian node, containing the first isolates from Greece between 2010 and 2022 and the second strains from Austria, the Czech Republic, Slovakia, Germany and Italy. The reconstruction shows a clear segregation of the Italian isolates from the other European strains. The Italian clade appears to originate from Austria, having in common a node dated 2009, with Austria being the most probable location. The first pure Italian node is dated in April 2010, with the first case reported in Ancona in 2011 as an outgroup. From the 2010 node, the eastern clade was differentiated in 2012 from the western clade with origin in the same year but continued in subsequent years. From this, the sequences were divided into many small subclades corresponding to the different epidemics that followed each other from 2014 to 2023 mainly in the regions of Lombardy, Veneto, Emilia-Romagna and Piedmont, where the new characterised cases are also located. The continuous phylogeography analysis conducted on the Italian subset, estimated the coordinates of the root of the tree corresponding to the province of Ravenna, between Marche (site of the first Italian isolation) and the course of the river Po and suggested the entry of WNV-2 in Italy between the end of 2007 and the beginning of 2008. The epidemic then spread simultaneously eastwards and westwards: the eastern strain expanded north-eastwards reaching Ferrara, Rovigo and Padua in the first half of 2013 and then apparently disappeared in the following year. The western strain, on the other hand, rapidly spread to an area between Cremona, Piacenza and Lodi in the second half of 2013, reaching Milan in 2014 and then Pavia. The diffusion of the same strain showed a deviation towards Mantua and Verona between 2013 and 2014. Since 2014, the western strain has simultaneously expanded into Lombardy and Emilia-Romagna, also reaching the Piedmont region in 2022 and 2023. The mutation screening performed on the Italian subset showed specific mutation patterns for each subclade. Most mutations were synonymous, while 28 resulted in amino acid changes, 3 of which were found to be under positive selective pressure. The new methodology enabled us to obtain sequences even from samples with a low viral load (≤32 Ct), a characteristic that is often common in environmental isolates. The phylogenetic and phylogeographical analyses conducted on the complete European and Italian genomes produced results in agreement with those found in the literature, confirming the first entry of the virus into Europe from Hungary in 2004 and its subsequent spread towards Greece and Austria, underlining its key role in the propagation of the virus towards other European states, including Italy. The mutation analysis revealed distinctive mutational patterns of the different Italian significant subclades, suggesting the co-circulation of different viral populations. Moreover, two of the mutations subjected to positive selective pressure, F49L in NS2A and M184V in NS4B, would seem to be involved in the increased tropism towards neuronal cells (the first one) and in the increased pathogenicity of the virus (the second one). The presence of these mutations mainly in environmental samples suggests that these mutants are not due to an evasion mechanism of the human immune response but are naturally circulating. The continuous phylogeography has finally reconstructed the virus' diffusion routes with more precision, confirming the viral flow along the main tributaries of the Po, in areas with a high density of migratory birds and local avifauna. Observation of the virus' spread flows has revealed a progressive shift in circulation towards the westernmost regions of Italy, also confirmed by the recent involvement of Piedmont among the areas most affected by infection. Our analyses also confirm that the virus requires a period of enzootic circulation between reservoir animals (birds) and the mosquitoes that transmit it, before causing epidemics in humans. Our results demonstrate once again the usefulness of phylogenetic and bioinformatic methods in the more precise monitoring of phenomena that are difficult to detect but have a significant impact on human health.

Gli arbovirus possiedono un genoma a RNA e sono classificati in base alle caratteristiche strutturali ed ai criteri ecologici (modalità di trasmissione). Le famiglie virali maggiormente rappresentate sono Bunyaviridae, Flaviviridae e Togaviridae. Il virus West Nile appartiene al genere Orthoflavivirus (famiglia Flaviviridae) ed è mantenuto in natura grazie ad un ciclo di trasmissione enzootico (ciclo endemico) che vede come protagonisti le zanzare ornitofile adulte (Culex), che fungono da vettori, e gli uccelli viremici, che fungono da ospiti amplificatori. Nel caso in cui una zanzara punga un soggetto definito dead end (uomo o cavallo), ovvero un ospite che non sviluppa una carica virale tale da garantire il proseguo dell’infezione, si parla di ciclo epidemico. Dal punto di vista della sintomatologia, le infezioni hanno un decorso generalmente asintomatico (~80%). Nel 20% circa dei casi, l'infezione si manifesta con sintomi simil influenzali lievi (febbre, mal di testa, dolori muscolari e articolari, stanchezza, nausea e, a volte, rash cutaneo), definiti come febbre di West Nile. In circa l’1% dei casi l’infezione evolve in forme più gravi, con coinvolgimento del sistema nervoso centrale. Dall’analisi filogenetica, sono noti 9 lineage virali, di cui solamente L1 e L2 patogeni per l’uomo. La prima evidenza di WNV-2 in Italia è stata riportata nel 2011 nella provincia di Ancona per poi diffondersi rapidamente su tutto il territorio nazionale, sostituendo WNV-1. Dal 2011 ad oggi, il lineage 2 è il lineage più frequentemente identificato in Italia, con il maggior numero di casi riportati. Allo scopo di studiare l’evoluzione molecolare di West Nile virus L2 nel nostro Paese nelle stagioni 2022 e 2023, sono stati caratterizzati i genomi interi di 98 isolati ottenuti nel 2022 e 2023 da campioni animali (pool di zanzare e omogenati di organi di uccelli) nell’ambito del piano di monitoraggio di WNV attivo nel Nord Italia. Per l'amplificazione sono stati utilizzati due protocolli homemade che prevedevano l'utilizzo di pool di primers o di primers specifici. Gli amplificati sono stati successivamente sequenziate su piattaforme di Next Generation Sequencing. Le sequenze ottenute sono state unite a sequenze presenti su banche dati per la produzione di un dataset Europeo da cui è stato poi estratto un subset italiano. Sul dataset Europeo è stata condotta un’analisi di Maximum Likelihood, che ha stimato l’ingresso del virus nel 1998 ed evidenziato la presenza di 3 subclade significativi, in cui si raggruppavano rispettivamente isolati della Grecia, dell’Austria e dell’Italia. L’analisi filogeografica condotta sia sulla piattaforma Nextstrain sia con metodica Bayesiana, sul dataset Europeo ha stimato un ingresso di WNV-2 in Europa nel 2002 con località più probabile della radice l'Ungheria (sp=0,8), che si pone come outgroup rispetto a tutte le sequenze europee presenti nell'albero. Dal nodo ungherese si distaccano due clade significativi, contenenti il primo isolati in Grecia fra il 2010 ed il 2022 e il secondo ceppi dell'Austria, Repubblica Ceca, Slovacchia, Germania ed Italia. La ricostruzione mostra una segregazione netta degli isolati italiani rispetto agli altri ceppi europei. Il clade italiano sembra essersi originato dall'Austria, avendo in comune con quest'ultima un nodo datato nel 2009, con location più probabile proprio l'Austria. Il primo nodo puro italiano è datato nel mese di aprile del 2010, con il primo caso riportato ad Ancona nel 2011 posto come outgroup. Dal nodo del 2010, si differenziavano il clade orientale nell'anno 2012 quello occidentale con origine nello stesso anno ma proseguito negli anni successivi. Da quest'ultimo, le sequenze si sono divise in tanti piccoli subclade corrispondenti alle diverse epidemie che si sono susseguite dal 2014 al 2023 principalmente nelle regioni Lombardia, Veneto, Emilia-Romagna e in Piemonte, dove si pongono anche i nuovi caratterizzati. L’analisi di filogeografia continua condotta sul subset italiano, ha stimato le coordinate della radice dell’albero corrispondenti alla provincia di Ravenna, tra le Marche (luogo del primo isolamento italiano) e il corso del fiume Po ed ha ipotizzato l’entrata di WNV-2 in Italia tra la fine del 2007 e l’inizio del 2008. L'epidemia si è poi diffusa simultaneamente verso Est e verso Ovest: il ceppo orientale si è propagato verso Nord-Est raggiungendo Ferrara, Rovigo e Padova nella prima metà del 2013 per poi essersi apparentemente estinto nell’anno successivo. Il ceppo occidentale, invece, si è rapidamente diffuso in una zona fra Cremona, Piacenza e Lodi nella seconda metà del 2013, raggiungendo Milano nel 2014 e successivamente Pavia. La diffusione dello stesso ceppo ha mostrato una deviazione verso Mantova e Verona tra il 2013 e il 2014. Dal 2014 ad oggi il ceppo occidentale si è simultaneamente espanso in Lombardia e in Emilia-Romagna, arrivando anche nella regione del Piemonte nel 2022 e 2023. Lo screening delle mutazioni effettuato sul subset italiano ha evidenziato a presenza di pattern mutazionali specifici per ogni subclade. La maggior parte delle mutazioni erano sinonime, mentre 28 portavano a cambiamento amminoacidico, 3 delle quali risultate essere sottoposte a pressione selettiva positiva. La nuova metodica ci ha permesso di ottenere le sequenze anche di campioni con una carica virale bassa (≤32 Ct), caratteristica spesso comune negli isolati ambientali. Le analisi filogenetiche e filogeografiche condotte sui genomi completi europei ed italiani hanno restituito risultati concordi con quanto presente nei dati di letteratura, confermando il primo ingresso del virus in Europa dall’Ungheria nel 2004 e la sua successiva diffusione verso Grecia e Austria, sottolineando il ruolo chiave di quest’ultima nella propagazione del virus verso gli altri stati europei, tra cui l’Italia. L’analisi delle mutazioni ha messo alla luce pattern mutazionali distintivi dei differenti subclade significativi italiani, suggerendo la co-circolazione di diverse popolazioni virali. Inoltre, due delle mutazioni sottoposte a pressione selettiva positiva, F49L in NS2A e M184V in NS4B, sembrerebbero essere coinvolte nell'aumento del tropismo verso le cellule neuronali (la prima) e nella maggiore patogenicità del virus (la seconda). La presenza di queste mutazioni principalmente nei campioni ambientali suggerisce che tali mutanti non sono dovuti ad un meccanismo di evasione della risposta immunitaria dell'uomo, ma sono normalmente circolanti in natura. La filogeografia continua ha infine permesso di ricostruire con maggiore precisione le rotte di diffusione del virus, confermando il flusso virale lungo i principali affluenti del Po, in zone ad alta densità di uccelli migratori e di avifauna locale. Dall'osservazione dei flussi di diffusione del virus è emerso un progressivo spostamento della circolazione verso le regioni più occidentali dell'Italia, confermato anche dal recente coinvolgimento del Piemonte tra le zone più colpite dalle infezioni. Le nostre analisi confermano inoltre che il virus necessita di un periodo di circolazione enzootica tra gli animali serbatoio (gli uccelli) e le zanzare che lo trasmettono, prima di provocare epidemie nell'uomo. I nostri risultati dimostrano ancora una volta l'utilità dei metodi filogenetici e bioinformatici nel monitoraggio più preciso di fenomeni difficili da rilevare ma con un significativo impatto sulla salute umana.