Nanoscale characterization of Polycomb proteins in 2D/3D cell cultures: shedding light on epigenetic regulation and opening to biosensing applications

Polycomb Group proteins (PcG) are negative transcription factors involved in forming facultative heterochromatin through histone modifications, thereby they are responsible for maintaining cell identity and regulating early development. Discovered in flies and evolutionarily conserved, they are divided into two complexes: PRC1, which compacts chromatin and monoubiquitylates histone H2A, and PRC2, which trimethylates histone H3. Among PRC1 members, polyhomeotic proteins PHC1, PHC2, and PHC3 are able to form long-range interactions and influence chromatin condensation. Despite their dysregulation in tumours such as glioblastoma and thyroid carcinoma, the specific roles of PHCs in chromatin remodelling remain unclear. This PhD project aimed to characterize the role of PHC2 and PHC3 in human thyroid cell lines for bioimaging applications, utilizing techniques including confocal and super-resolution microscopy. The study involved primary thyrocytes, papillary carcinoma TPC-1, and follicular epithelial Nthy-ori 3-1, as well as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell lines, Patu-T wt and PANC-1. PcG proteins were analyzed using real-time qPCR and indirect immunofluorescence. Silencing PHC2 and PHC3 in thyroid and pancreatic lines revealed a correlation between their downregulation and thyroid tumor onset, while reducing invasiveness in PDAC cells. Additionally, 3D culture models were developed from primary thyrocytes to create organoid models that maintain the identity of thyroid gland. These models were later replaced by spheroids from immortalized lines to better emulate healthy and tumorous conditions. Immunofluorescence staining confirmed that PHC condensates maintained their typical nuclear pattern in 3D cultures. A chimeric PHC2-EGFP protein was created for live cell studies, although attempts to create PHC3-EGFP were unsuccessful. Overall, this research highlights the role of Polycomb proteins in chromatin remodelling and tumorigenesis, suggesting that further bioimaging studies in 3D models could enhance our understanding of their functions.

Le proteine del gruppo Polycomb (PcG) sono fattori di trascrizione coinvolti nella formazione dell'eterocromatina facoltativa e nella regolazione epigenetica della cromatina tramite modifiche post-traduzionali degli istoni. Pertanto, sono in grado di modulare la compattazione della cromatina, svolgendo un ruolo chiave nel mantenimento dell'identità cellulare, nella repressione genica e nelle fasi iniziali dello sviluppo. Le proteine Polycomb sono conservate evolutivamente e presenti in molte specie, tra cui gli esseri umani. I Polycomb sono suddivisi in due complessi principali: PRC1 e PRC2. PRC1 compatta la cromatina e catalizza la monoubiquitinazione della lisina 119 dell'istone H2A, mentre PRC2 trimetila la lisina 27 dell'istone H3, segnando la repressione trascrizionale e facilitando l'attracco di PRC1. Le proteine PHC1, PHC2 e PHC3 di PRC1, con domini particolari che favoriscono la formazione di complessi, sono coinvolte nella creazione di domini condensati che regolano la cromatina a livello mesoscopico. Questi complessi, attraverso la formazione di "PcG bodies" nucleari, sono implicati nella repressione genica. Tuttavia, il ruolo specifico delle PHC nel rimodellamento della cromatina è ancora poco chiaro, sebbene la loro disregolazione sia associata a tumori, come il glioblastoma multiforme e il carcinoma tiroideo, suggerendo un impatto nella trasformazione tumorale. Le PHC potrebbero contribuire alla transizione da cellule sane a tumorali, influenzando la tumorigenesi. Per investigare il ruolo dei Polycomb nella tumorigenesi, in questo progetto di dottorato sono state impiegate linee cellulari tiroidee umane e di adenocarcinoma pancreatico (PDAC). Sono stati utilizzati metodi come real-time qPCR, per misurare i livelli di mRNA, e immunofluorescenza indiretta, per analizzare l'espressione e la localizzazione delle proteine PcG. Il silenziamento delle proteine PHC2 e PHC3 ha mostrato come la loro sotto-regolazione in linee tiroidee possa essere associata all’insorgenza del tumore papillare tiroideo, mentre abbia ridotto l'invasività tumorale nelle linee PDAC. Sono stati sviluppati modelli di coltura 3D da tireociti primari e linee immortalizzate come Nthy-ori 3-1 e TPC-1. Con questi modelli, utilizzati per il bioimaging, si è dimostrato il mantenimento della caratteristica distribuzione dei condensati PHC anche nelle colture tridimensionali. La realizzazione di un plasmide PHC2-EGFP ha permesso di osservare la localizzazione di PHC2 in sistemi 2D e 3D. La caratterizzazione delle proteine Polycomb ha evidenziato il loro impatto sulla tumorigenesi e sulla migrazione delle cellule tumorali, suggerendo che un'ulteriore analisi delle loro interazioni tramite bioimaging potrebbe rivelare nuovi meccanismi alla base della regolazione epigenetica e della metastasi.