Characterization of the oncogenic role of the E3 ubiquitin ligase WWP1 haematological malignancies

Acute leukaemia is a worldwide disease with an incidence of approximately 4/100000 per year; 70% of the cases are affected by acute myeloid leukaemia (AML), by far the most common type among adults. The salient pathologic features of AML are a differentiation block at specific stages of myeloid maturation and the excessive accumulation of immature myeloid blasts in the bone marrow, interfering with normal hematopoiesis, and contributing to the bone marrow failure that is the most common cause of death. AML is an heterogeneous disorder characterized by the presence and, often the coexistence, of different mutations, epigenetic changes and chromosomal aberrations, Although patient survival has increased in recent years with the availability of novel agents, chemoresistance remains a major problem in cancer management and the identification of novel therapeutic targets is a urgent need in the field. The E3 ubiquitin ligase WWP1 is an oncogene found deregulated in epithelial human cancers in which its overexpression has been associated with increased cancer cell proliferation and survival and with adverse disease outcome. WWP1 controls protein stability and/or function of several substrates crucially involved in the regulation of differentiation, cell cycle and apoptosis, thus empathizing its oncogenic activity. Here we report that the expression of WWP1 is significantly augmented also in a large cohort of primary AML patients, compared with haematopoietic cells from healthy donors. We show that WWP1 loss inhibits cell proliferation in AML, CML, b-CLL and t-ALL cell lines with a growth inhibition phenotype recapitulated in vivo by the reduced leukaemic potential of WWP1-depleted AML cells upon transplantation into immunocompromised mice. Mechanistically, WWP1 inactivation induces the accumulation of its protein substrate p27Kip1, followed by cell cycle arrest. In addition, WWP1 depletion triggers the autophagy signaling and thus reduces survival of leukaemic cells. Furthermore, WWP1 inactivation promotes autophagy-mediated degradation of PML-RARα and FLT3-ITD oncoproteins, in NB4 and MV4.11 cells respectively, consequently fostering myeloid maturation of leukaemic cells. Our preliminary data also show that WWP1 depletion confers sensitivity to clinically used DNA-damaging agents, such as doxorubicin. Furthermore, in order to identify relevant targets of WWP1 oncogenic activities, we have undertaken an ubiquitin remnant profiling approach. The screening revealed that WWP1 might regulate chemosensitivity of cancer cells by modulating the DNA damage response. Together, our findings provide molecular insights into the anti-cancer potential of WWP1 inhibition in leukemia, and suggest that WWP1 represents a potentially promising druggable target in haematological malignancies.

La leucemia acuta è una malattia molto diffusa con un'incidenza di circa 4/100000 casi all'anno; il 70% dei casi è affetto da leucemia mieloide acuta (AML), di gran lunga il tipo più comune tra gli adulti. Le caratteristiche patologiche salienti dell'AML sono un blocco nel differenziamento a specifici stadi della maturazione mieloide e l'eccessivo accumulo di blasti mieloidi immaturi nel midollo osseo, interferendo con la normale emopoiesi e contribuendo alla depressione del midollo osseo che è la causa più comune di morte. L'AML è una malattia eterogenea caratterizzata dalla presenza e, spesso dalla coesistenza, di mutazioni diverse, alterazioni epigenetiche e aberrazioni cromosomiche, sebbene la sopravvivenza del paziente sia aumentata negli ultimi anni con la disponibilità di nuovi agenti, la chemioresistenza rimane un problema importante nella gestione del cancro e l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici è un'esigenza urgente nel campo. L'ubiquitina ligasi E3 WWP1 è un oncogene trovato deregolamentato nei tumori umani epiteliali in cui la sua iperespressione è stata associata ad un aumento della proliferazione e sopravvivenza delle cellule tumorali e ad esito avverso della malattia. WWP1 controlla la stabilità e/o la funzione delle proteine di diversi substrati coinvolti in modo cruciale nella regolazione del differenziamento, del ciclo cellulare e dell'apoptosi, enfatizzando così la sua attività oncogenica. In questo studio riportiamo che l'espressione di WWP1 è significativamente aumentata anche in una grande coorte di pazienti con AML primarie, rispetto alle cellule ematopoietiche da donatori sani. Dimostriamo che la perdita di WWP1 inibisce la proliferazione cellulare nelle linee cellulari AML, CML, b-CLL e t-ALL con un fenotipo di inibizione della crescita ricapitolato in vivo dal ridotto potenziale leucemico delle cellule AML in cui WWP1 è stato silenziato, dopo trapianto in topi immunocompromessi. Meccanicisticamente, l'inattivazione di WWP1 induce l'accumulo del suo substrato proteico p27Kip1, seguito dall'arresto del ciclo cellulare. Inoltre, la deplezione di WWP1 innesca la segnalazione autofagica e quindi riduce la sopravvivenza delle cellule leucemiche. Ulteriormente, l'inattivazione di WWP1 promuove la degradazione, mediata dall'autofagia, delle oncoproteine PML-RARα e FLT3-ITD, rispettivamente nelle cellule NB4 e MV4.11, favorendo in tal modo la maturazione mieloide delle cellule leucemiche. I nostri dati preliminari mostrano anche che la deplezione di WWP1 conferisce sensibilità agli agenti dannosi per il DNA utilizzati clinicamente, come la doxorubicina. Al fine di identificare gli obiettivi rilevanti delle attività oncogeniche del WWP1, abbiamo intrapreso un approccio di profiling in grado di identificare peptidi ubiquitinati analizzando, a seguito di una digestione mirata, la porzione di legame dell’ubiquitina. Lo screening ha rivelato che il WWP1 potrebbe regolare la chemiosensibilità delle cellule tumorali modulando la risposta al danno del DNA. Insieme, le nostre scoperte forniscono informazioni molecolari sul potenziale anti-tumorale dell'inibizione di WWP1 nelle leucemie e suggeriscono che WWP1 rappresenta un bersaglio potenzialmente promettente, farmacologicamente targettabile nelle neoplasie ematologiche.