Synthesis and characterization of new NBD-based GSTP1-1 inhibitors for cancer treatment

The glutathione transferases (GSTs) are one of the most important families of detoxifying enzymes in nature. The classic activity of the GSTs is conjugation of compounds, bearing an electrophilic center, to the tripeptide glutathione (GSH), but other related activities are now associated with GSTs, including steroid and leukotriene biosynthesis, peroxide degradation, double-bond cis-trans isomerization, dehydroascorbate reduction, Michael addition, and non-catalytic ‘ligandin’ activity (ligand binding and transport). It has been clearly shown that overexpression of GSTs, in particular of the isoenzyme GSTP1-1, and high levels of GSH in tumors are linked to drug resistance. These findings seem to be correlated to an alternative non-catalytic role of the GSTs. Apparently, besides their active role in the detoxification of antitumor drugs, GSTs are also involved in the regulation of apoptosis through the inhibition of the c-Jun-N-terminal kinase (JNK) signaling pathway. In order to avoid this phenomenon, a large variety of compounds capable to inhibit GSTP1- 1 have been synthesized and studied, and among them, the nitrobenzoxadiazole (NBD) derivative NBDHEX (1) and its analogue MC3181 (2) have proved to be highly efficient in triggering apoptosis in several human tumor cell lines, both sensitive and resistant to pharmacological treatment. In order to improve the stability of these compounds, new derivatives have been designed and synthesized, in particular, MC2753 (3) and MC2752 (4). Between them, 3 revealed an unusual behavior. This benzoic ester derivative of 1 causes a half-site inhibition of GSTP1-1. Therefore, in the first part of my thesis I dissected the inhibition mechanism of 3, obtaining new insights into the binding behavior of GSTP1-1. Unfortunately, compound 3 is rapidly hydrolyzed by the cellular esterases and for this reason it was not possible to evaluate its cytotoxic efficacy in vitro. In the attempt to improve the hydrolytic stability of 3, the ester group was replaced with an amide function, leading to MC4351 (5), that I characterized in the second part of the work. Unlike 3, 5 is not hydrolyzed by the human liver microsomal carboxylestarases, but retains some peculiar properties of 3, such as the ability to disrupt the interaction between GSTP1-1 and the adaptor protein TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) regardless of GSH levels. Moreover, this benzamide derivative exhibits both a higher stability in the presence of GSH and a greater cytotoxicity towards cultured A375 melanoma cells, compared to both the parent compound 1 and its water-soluble analogue 2. A strategy to increase the solubility of NBD derivatives consists in their conversion into prodrugs, molecules that require a transformation within the body to release the active compound. Therefore, the succinic acid monoester of compound 1 and the phosphoric ester derivatives of both 1 and 2 were synthesized. In the last part of my PhD thesis I analyzed their chemical-physical properties and cytotoxic efficacy in vitro. Finally, the phosphoric ester derivatives have been selected to test their antitumor activity in vivo. The tested compounds, in particular the per os regimen of the phosphoric ester derivative of 2 (compound 8), exhibited an anti-neoplastic activity comparable to that of temozolomide but with longer lasting effects after withdraw of the treatment. Moreover, the new molecules were well tolerated, even after prolonged administration.

Le glutatione transferasi (GST) sono una delle più importanti famiglie di enzimi detossificanti in natura. L’attività classica delle GST è la coniugazione di composti caratterizzati da centri elettrofili con il tripeptide glutatione (GSH), ma sono conosciute anche altre attività associate alle GST, come ad esempio la biosintesi di steroidi e leucotrieni, la degradazione dei perossidi, l’isomerizzazione cis-trans di doppi legami, la riduzione del deidroascorbato, le reazioni di addizione di Michael e un’attività non catalitica di ‘ligandina’ (legame di ligandi e loro trasporto). È stato chiaramente dimostrato che l’iper-espressione delle GST, in particolare dell’isoforma GSTP1-1, così come gli alti livelli di GSH nei tumori sono collegati al fenomeno della farmaco resistenza. Queste evidenze sembrano essere correlate ad un ruolo non catalitico alternativo delle GST. Infatti, oltre al loro ruolo attivo nella detossificazione di farmaci antitumorali, le GST sono anche coinvolte nella regolazione dell’apoptosi attraverso l’inibizione della via di segnale di c-Jun-Nterminal kinase (JNK). Per cercare di impedire questo fenomeno, sono stati sintetizzati e studiati una grande varietà di composti capaci di inibire la GSTP1- 1. Tra questi, sono risultati particolarmente efficaci l’NBDHEX (1) e MC3181(2), derivati del nitrobenzossadiazolo in grado di indurre apoptosi in linee cellulari tumorali sia sensibili che resistenti al trattamento farmacologico. Con l’obiettivo di migliorare la stabilità di questi composti, sono stati progettati e sintetizzati nuovi analoghi, in particolare, MC2753 (3) and MC2752 (4). Tra queste nuove molecole, è stato trovato di particolare interesse il composto MC2753 (3), a causa del suo inusuale comportamento. Questo derivato benzoico di 1 si comporta come un inibitore ‘half-site’ nei confronti della GSTP1-1. Per questo motivo, nella prima parte del lavoro ho studiato il meccanismo di inibizione di 3, ottenendo nuovi dettagli sulle proprietà di legame della GSTP1-1. Sfortunatamente questo composto viene rapidamente idrolizzato dalle esterasi cellulari e per questo motivo non è stato possibile valutare la sua efficacia citotossica in vitro. Nel tentativo di migliorare la stabilità idrolitica di 3, il suo gruppo estere è stato sostituito con una funzione ammidica, ottenendo così il composto MC4351 (5). Nella seconda parte del lavoro di tesi ho quindi caratterizzato questo composto. Al contrario di 3, 5 non viene idrolizzato dalle carbossilesterasi microsomiali di fegato umano, ma mantiene alcune delle proprietà caratteristiche di 3, come l’abilità di indebolire l’interazione tra la GSTP1-1 e la proteina adattatrice TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) indipendentemente dai livelli di GSH. Inoltre, questo derivato benzammidico mostra sia un’alta stabilità in presenza di GSH sia una maggiore citotossicità verso le cellule di melanoma A375, rispetto al composto di partenza 1 e al suo derivato idrosolubile 2. Una strategia per migliorare la solubilità dei derivati nitrobenzossadiazolici consiste nel convertirli in profarmaci, molecole che richiedono una trasformazione all’interno dell’organismo per rilasciare la molecola attiva. Quindi, sono stati sintetizzati sia il derivato succinico del composto 1 sia gli estere-fosforici dei composti 1 e 2. Nell’ultima parte di questo lavoro ho analizzato le nuove molecole sia per le loro caratteristiche chimico-fisiche che per la loro efficacia citotossica in vitro. Infine, entrambi i derivati estere-fosforici di 1 e 2 sono stati selezionati per verificare la loro attività antitumorale in vivo. I composti esaminati, in particolare il derivato estere-fosforico del composto 2 (composto 8) somministrato per via orale, hanno mostrato un'attività antineoplastica paragonabile a quella della temozolomide ma con effetti più duraturi dopo la sospensione del trattamento. Inoltre, le nuove molecole sono state ben tollerate, anche dopo una somministrazione prolungata.