Evaluation of HIV-1 genetic variability, HIV-1 drug resistance and virological response in relation with the last generation of antiretroviral classes: integrase inhibitors and attachment inhibitors

The overall goal of this thesis was to evaluate HIV-1 genetic variability, HIV-1 drug resistance and virological response in relationship with the last generation of antiretroviral classes. In particular, this thesis aimed to: i) provide evidence on the virological efficacy and resistance profile of integrase inhibitors (INIs) in both combined antiretroviral therapy (cART)- naïve and cART-experienced HIV-1 infected individuals by analysing data from real-life settings; ii) describe the gp120 polymorphisms potentially associated with resistance to fostemavir (FTV). First, the virological response and resistance profile were evaluated in HIV-1 infected patients starting a first-line INI-based regimen among 798 patients: 38.6% received raltegravir, 27.1% elvitegravir, and 34.3% dolutegravir. Baseline resistance to nucleos(t)ide reverse transcriptase inhibitors (NRTIs), non-NRTIs (NNRTIs), protease inhibitors (PIs) and INIs was 3.9%, 13.9%, 1.6% and 0.5%, respectively. Overall, by 12 months of cART, the probability of virological success (VS) was 95%, while the probability of virological rebound (VR) by 36 months after VS was 13.1%. No significant differences in VS or VR were found according to the INI used. No association with pre-cART resistance and virological response was found. Whereas, survival analysis highlighted a negative role of high pre-cART viremia and low CD4 cell count on VS, but not on VR. Forty-three (5.3 %) individuals failed their cART, (30 under raltegravir; 9 under elvitegravir; 4 under dolutegravir). INI-resistance associated mutations were observed only in patients failing the first generation INIs elvitegravir and raltegravir, while individuals failing DTG did not harbour any resistance mutation either in integrase or reverse transcriptase. The findings confirm that patients receiving an INI-based first-line regimen achieve and maintain very high rates of VS in clinical practice. Secondly, concerning the integrase natural polymorphisms (INp) among cART-naïve individuals, 58 INps were found, of which 48 codons significantly varied among HIV-1 subtypes. Despite this high variability, any significant impact of the HIV-1 subtype, the presence of ARMs or INps on the achievement of VS to first-line INI-based regimens was found. However, compared to other HIV-1 subtypes, individuals infected by subtype F showed a significant higher probability of VR. Regarding this aspect, individuals harbouring novel polymorphic mutations I84L, T124S or L234V, all associated with F subtype, showed a significantly higher probability of VR. Overall, these findings show that the presence of F-subtype related polymorphisms impacts on poorer virological control. Further investigations are needed to clarify these observations. Thirdly, virological response and resistance profile was evaluated in cART-experienced HIV-1 infected patients starting a dual therapy with dolutegravir and boosted-darunavir for the first time among 130 cART-experienced individuals (62 viremic and 68 virologically suppressed). At the moment of switch, 81.5% accumulated ≥1MRM (PI: 35.7%, NRTI: 77.5%; NNRTI: 69.0%; INI:10.1%), but 77.7% harboured strains fully susceptible to dolutegravir and darunavir. In viremic individuals, the overall probability of VS by 12 months after switch was 91.7%. In virologically suppressed individuals, by 24 months after switch, the probability of VR was 10.5%; individuals with previous time under virological suppression ≤6 months showed a higher VR probability compared to others (37.5% vs. 6.7%, P <0.002). Among 13 non-responding individuals, only two (15.4%) accumulated further resistance in integrase and protease. In sum, in highly treatment experienced patients, dual therapy with dolutegravir plus boosted-darunavir shows a high rate of virological control. Finally, regarding the evaluation of natural resistance to the new antiretroviral FTV and its potential association with other HIV-1 gp120 polymorphisms, 1997 HIV-1 B subtype gp120 sequences were analysed. The prevalence of clinically relevant mutations associated with resistance to FTV was low: L116Q (0.05%), S375H/M/T (0.55%, 1.35%, 17.73%, the latter being far less relevant in determining resistance), M426L (7.56%), M434I (4.21%) and M475I (1.65%). Some FTV resistance positions were positively correlated with specific gp120 polymorphisms: S375T with I371V; S375M with L134W, I154V and I323T; M475I with K322A; and M426R with G167N, K192T and S195N. These findings confirm that FTV can be considered as a promising therapeutic drug option in HIV-1 subtype B infected patients. However, HIV-1 gp120 amino acids showed variability in the absence of specific FTV pressure. A characterization of such HIV-1 gp120 polymorphisms potentially relevant for resistance to FTV deserves new in-depth in vitro and clinical investigations. In conclusion, the overall findings produced in this thesis demonstrated the high efficacy of INIs in achieving and maintaining virological control and their high genetic barrier to resistance in real-life settings, in both drug-naïve and drug-experienced individuals. These results therefore further support the usage of INIs for the treatment of HIV-1 infection. Moreover, from the virological point of view, the low prevalence FTV resistance mutations supports the introduction of this new antiretroviral in clinical practice for the treatment of HIV-1 subtype B infected patients.

L'obiettivo generale di questa tesi è stato quello di valutare la variabilità genetica dell'HIV-1, la farmaco-resistenza e la risposta virologica in relazione con l'ultima generazione di classi antiretrovirali. In particolare, attraverso questa tesi si è voluto: i) fornire evidenze sull'efficacia virologica e sul profilo di resistenza degli inibitori dell'integrasi (INI) sia in individui infetti da HIV-1 con esperienza alla terapia antiretrovirale (cART) che in soggetti cART-naive, analizzando dati da realife; ii) descrivere i polimorfismi di gp120 potenzialmente associati alla resistenza a fostemavir (FTV). La risposta virologica e il profilo di resistenza sono stati valutati in pazienti infetti da HIV-1 che iniziavano un regime di prima linea contenente INI in 798 pazienti: il 38,6% di essi era trattato con raltegravir, il 27,1% con elvitegravir e il 34,3% con dolutegravir. La resistenza al basale agli inibitori nucleosidici/nucleotidici della trascrittasi inversa (NRTI), ai non-NRTI (NNRTI), agli inibitori della proteasi (PI) e agli INI era rispettivamente del 3,9%, 13,9%, 1,6% e 0,5%. Complessivamente, dopo 12 mesi di cART, la probabilità di successo virologico (VS) era del 95%, mentre la probabilità di rialzo viremico (VR) dopo 36 mesi dal VS era del 13,1%. Non sono state trovate differenze significative nelle probabilità di VS o VR in relazione all’INI utilizzato. Non è stata trovata alcuna associazione tra la resistenza pre-cART e la risposta virologica. L'analisi di sopravvivenza ha invece evidenziato un ruolo negativo dell’alta carica virale pre-cART e del basso numero di CD4 pre-cART sul VS, ma non sul VR. Il fallimento della terapia è stato riscontrato in 44 (5,3%) individui (30 sotto raltegravir; 9 sotto elvitegravir; 4 sotto dolutegravir). Le mutazioni associate alla resistenza agli INI sono state osservate solo nei pazienti che non avevano risposto agli INI di prima generazione elvitegravir e raltegravir, mentre gli individui che avevano fallito a dolutegravir non presentavano alcuna mutazione di resistenza né nell'integrasi né nella trascrittasi inversa. Questi risultati confermano che i pazienti trattati con un regime di prima linea basato sull’INI raggiungono e mantengono tassi molto elevati di VS nella pratica clinica. Per quanto riguarda i polimorfismi naturali dell'integrasi (INp), sono stati trovati 58 INps in individui cART-naive, per 48 dei quali i codoni variavano significativamente fra i diversi sottotipi di HIV-1. Nonostante questa elevata variabilità, non è stata trovata nessuna correlazione significativa del il sottotipo, la presenza delle mutazioni accessorie o gli INps con il raggiungimento di VS sotto regimi di prima linea basati contenenti INI. E’ invece stata osservata un più alto probabilità di VR in individui infettati con sottotipo F rispetto agli altri individui infettati con altri sottotipi. A tal proposito, gli individui con le mutazioni polimorfiche I84L, T124S o L234V, tutte associate al sottotipo F, hanno mostrato una probabilità significativamente più alta di VR. Questi risultati mostrano che la presenza di polimorfismi relazionati al sottotipo F potrebbe giocare un ruolo negativo nel mantenimento del controllo virologico. Ulteriori indagini potranno aiutare a chiarire queste osservazioni. E’ stata valutata anche la risposta virologica e il profilo di resistenza in 130 pazienti con infezione da HIV-1 con esperienza allacART (62 viremici e 68 virologicamente soppressi), che iniziavano per la prima volta una duplice terapia con dolutegravir e darunavir boosterato. Al momento del cambio terapeutico , l'81,5% dei pazienti aveva accumulato almeno una MRM (PI: 35,7%, NRTI: 77,5%; NNRTI: 69,0%; INI: 10,1%); nonostante ciò, il 77,7% degli individui aveva comunque ceppi completamente suscettibili a dolutegravir e darunavir. Negli individui viremici, la probabilità di VS a 12 mesi dopo il cambio terapeutico era del 91,7%. Negli individui virologicamente soppressi, a 24 mesi dopo il cambio terapeutico, la probabilità di VR era del 10,5%; individui con un tempo precedente di soppressione virologica ≤6 mesi hanno mostrato una maggiore probabilità di VR rispetto agli altri (37,5% vs. 6,7%, P <0,002). Tra i 13 individui che non avevano risposto a dolutegravir più darunavir boosterato , solo due (15,4%) avevano accumulato ulteriore resistenza nell'integrasi e nella proteasi. Questi risultati evidenziano un alto tasso di controllo virologico in pazienti con lunga esperienza di cART, trattati con la duplice terapia contenente dolutegravir più darunavir boostato. Infine, per quanto riguarda la valutazione della resistenza naturale al nuovo farmaco antiretrovirale FTV e la sua potenziale associazione con altri polimorfismi della gp120 diHIV1, sono state analizzate 1997 sequenze della gp120 del sottotipo B. E’ stata riscontrata una bassa prevalenza di mutazioni clinicamente rilevanti associate alla resistenza a FTV: L116Q (0,05%), S375H/M/T (0,55%, 1,35%, 17,73%, quest'ultima è meno rilevante per la resistenza), M426L (7,56% ), M434I (4,21%) e M475I (1.65%). Alcune posizioni di resistenza a FTV sono state trovate positivamente correlate con specifici polimorfismi della gp120: S375T con I371V; S375M con L134W, I154V e I323T; M475I con K322A; e M426R con G167N, K192T e S195N. In generale, i risultati ottenuti da questo studio, confermano che FTV può essere considerato una promettente opzione terapeutica nei pazienti con infezione da HIV-1 di sottotipo B. Tuttavia, è da conisderare la variabilità degli amminoacidi della gp120 di HIV-1 riscontrata anche in assenza di pressione a FTV. Una caratterizzazione di tali polimorfismi potenzialmente rilevanti per la resistenza a FTV merita dunque nuove indagini cliniche e in vitro approfondite. In conclusione, i risultati complessivi prodotti in questa tesi hanno dimostrato l'elevata efficacia degli INI nel raggiungimento e mantenimento del controllo virologico, nonché la loro elevata barriera genetica alla resistenza in dati dalla realife, sia negli individui naïve in quelli con esperienza ai farmaci antiretrovirali. Questi risultati supportano quindi ulteriormente l'uso degli INI per il trattamento dell'infezione da HIV-1. Inoltre, dal punto di vista virologico, la bassa prevalenza delle mutazioni di resistenza a FTV supportano l'introduzione di questo nuovo farmaco antiretrovirale nella pratica clinica per il trattamento dei pazienti infettati con HIV-1 di sottotipo B.