Farmacologia dei canali del cloro della famiglia CLC responsabili di malattie rare

Myotonia congenita (MC) is a rare disease characterized by impaired muscle relaxation and muscle stiffness. It is caused by loss-of-function mutations of the CLCN1 gene, encoding for the muscular isoform of the chloride channel ClC-1. Nowadays no direct activators of ClC-1 are known and the current therapy is symptomatic and based on mexiletine, a sodium channel blocker. However, its use is not suitable for all the patients and identifying new ClC-1 modulators is a medical need. We have previously demonstrated that the non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), niflumic acid (NFA), is a reversible inhibitor of wild-type (WT) ClC-1 channels and acts as a pharmacological chaperone of ClC-1 myotonic mutants with defect in proteostasis. The first aim of this project was to screen the activity of other NSAIDs related to NFA on WT and mutant ClC-1 to identify other potential pharmacological chaperones. A second purpose was to develop innovative 2D and 3D cellular models of adult skeletal muscles derived from immortalized human myoblasts or hiPSCs (human induced pluripotent stem cells) for the study of non-dystrophic myotonias. Thus, the gene and protein expression of ClC-1 and Nav1.4 was studied during differentiation into myotubes in 2D and 3D cell cultures. The acute activity of six NSAIDs was tested at different concentrations on WT ClC-1. All drugs showed a dose-dependent and reversible inhibitory activity, with tolfenamic and flufenamic acid (FFA) resulting the most potent molecules. The chaperone property of FFA was investigated on cells expressing the myotonic ClC-1 mutant p.A531V. The instantaneous and the steady-state currents intensity and the ClC-1 protein expression in the membrane were significantly increased after 24 hours incubation with the drug compared to control cells, demonstrating the pharmacological chaperone activity of FFA. In 2D culture of immortalized human myoblasts, the expression of ClC-1 and Nav1.4 was increased in the later stages of differentiation (D7-D9). The ClC-1 protein expression was confirmed in 3D muscles grown on a hydrogel matrix and these muscles were used for a first attempt to modelling myotonia congenita in vitro, using a ClC-1 inhibitor, 9-AC (anthracene-9-carboxylic acid). In myotubes derived from hiPSCs, preliminary data showed that Nav1.4 and ClC-1 displayed little expression at D7, suggesting a delay in myotube differentiation. Supplementation with a cocktail of specific small molecules (SB431542, DAPT, dexamethasone and forskolin) improved differentiation with a greater expression of myosins and Nav1.4; nevertheless, no ClC-1 expression was detected. Switching to the 3D muscle model differentiation improved, allowing detection of Nav1.4 and ClC-1 protein expression. In conclusion, we identified various NSAIDs exerting reversible inhibition of ClC-1, pointing them as starting molecules for the design of new ClC-1 modulators. Among these, FFA showed chaperone activity on the ClC-1 trafficking-defective mutant, p.A531V. Such results warrant confirmation in a model more similar to skeletal muscle. Our preliminary data suggest that the 2D and 3D models deriving from immortalized human myoblasts could be used for the study of MC due to chloride channel mutations. Conversely, the 2D myotubes model deriving from hiPSCs retained a predominant embryonic phenotype and may require further improvement for the study of adult skeletal muscles, including supplementation with molecules promoting differentiation and 3D cell culture. Altogether, our study paves the way for the identification of specific skeletal muscle ClC-1 channel modulators for the design of personalized therapy in non-dystrophic myotonias.

La miotonia congenita (MC) è una malattia rara caratterizzata da un’alterazione del rilassamento muscolare e da rigidità muscolare. È causata da mutazioni con perdita di funzione del gene CLCN1 che codifica per l’isoforma muscolare del canale del cloro ClC-1. Attualmente, non esistono attivatori diretti del ClC-1 e la terapia disponibile è sintomatologica, basata sulla mexiletina, un bloccante dei canali del sodio. Tuttavia, il suo uso non è indicato per tutti i pazienti e identificare nuovi modulatori del ClC-1 è una necessità medica. Abbiamo precedentemente dimostrato che il farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS) acido niflumico (NFA) è un inibitore reversibile dei canali ClC-1 wild-type (WT) e agisce come chaperone farmacologico per mutanti miotonici di ClC-1 con difetti di proteostasi. Il primo obiettivo di questo progetto è stato esaminare l’attività di altri FANS correlati all’NFA sul ClC-1 WT e mutato, per identificare altri potenziali chaperone farmacologici. Il secondo è stato quello di sviluppare modelli cellulari innovativi 2D e 3D di muscoli scheletrici adulti derivati da mioblasti umani immortalizzati o da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), per lo studio delle miotonie non-distrofiche. Dunque, si è analizzata l’espressione genica e proteica di ClC-1 e Nav1.4 durante il differenziamento in miotubi in colture 2D e 3D. L’attività acuta di sei FANS è stata testata a diverse concentrazioni sul ClC-1 WT. Tutti i farmaci hanno mostrato un’attività inibitoria dose-dipendente e reversibile, con acido tolfenamico e flufenamico (FFA) quali molecole più potenti. Le proprietà di chaperone dell’FFA sono state esaminate in cellule esprimenti il mutante miotonico ClC-1 p.A531V. Dopo 24 ore di incubazione con il farmaco, si è osservato un aumento significativo dell’intensità della corrente istantanea e stazionaria e dell’espressione della proteina ClC-1 nella membrana rispetto alle cellule controllo, dimostrando l’attività di chaperone farmacologico dell’FFA. Nelle colture 2D di mioblasti umani immortalizzati, l’espressione di ClC-1 e Nav1.4 è risultata aumentata negli stadi avanzati del differenziamento (D7-D9). L’espressione della proteina ClC-1 è stata confermata nei muscoli 3D cresciuti su hydrogel, utilizzati poi per un primo tentativo di modelling in vitro della miotonia congenita usando l’inibitore del ClC-1, 9-AC (acido antracen-9-carbossilico). Nei miotubi derivati da hiPSCs, i dati preliminari hanno mostrato una scarsa espressione di Nav1.4 e ClC-1 al D7, suggerendo un ritardo nel differenziamento. L’aggiunta di un cocktail di molecole specifiche (SB431542, DAPT, desametasone e forskolina) ha migliorato il differenziamento, aumentando l’espressione delle miosine e di Nav1.4; tuttavia, non è stata rilevata l’espressione di ClC-1. Con il modello muscolare 3D, il differenziamento è migliorato, permettendo il rilevamento dell’espressione delle proteine Nav1.4 e ClC-1. In conclusione, abbiamo identificato diversi FANS con effetto inibitorio reversibile sul ClC-1, proponendoli come molecole di partenza per sviluppare nuovi modulatori di ClC-1. Tra questi, l’FFA ha dimostrato un’attività di chaperone sul mutante p.A531V con difetti di trafficking. Questi risultati necessitano di conferma in modelli più simili al muscolo scheletrico. I dati preliminari suggeriscono che i modelli 2D e 3D derivati da mioblasti umani immortalizzati siano adatti allo studio della MC dovuta a mutazioni del canale del cloro. Invece, il modello 2D derivato da hiPSCs conserva un fenotipo prevalentemente embrionale e richiederebbe ulteriori ottimizzazioni per studiare il muscolo scheletrico adulto, come l’uso di molecole favorenti il differenziamento e colture 3D. Complessivamente, questo studio apre la strada all’identificazione di modulatori specifici di ClC-1 nel muscolo scheletrico per il design di terapie personalizzate nelle miotonie non-distrofiche.