“Ricerca e Validazione di Biomarcatori per la Identificazione Preventiva ed il Monitoraggio del Trattamento Farmacologico in soggetti ad alto rischio di Stroke Criptogenico”

“Research and Validation of Biomarkers for the Preventive Identification and Monitoring of Pharmacological Treatment in subjects at high risk of Cryptogenic Stroke” Background and Aims: The thesis project hypothesizes that folate cycle dysmetabolism due to the MTHFR C677T mutation may represent an unidentified factor in the pathogenesis of embolic stroke of undetermined origin (ESUS). Investigations have revealed that this mutation is associated with higher levels of endothelial dysfunction and atrial fibrosis (AFib) , both central determinants of the recently proposed concept of “atrial cardiomyopathy.” This anatomical and electrophysiological entity could serve as a common substrate for ESUS and some conditions previously considered possible causes, particularly atrial fibrillation. Furthermore, methotrexate (MTX), a widely used chemotherapeutic and immunosuppressive agent, was observed to induce the same phenotypic alterations in stable endothelial cell lines and circulating endothelial progenitor cells (EPCs) from control patients as those observed in EPCs from patients with the mutation MTHFR C677T. Methods: We recruited 59 Atrial Fibrillation (AF) patients (General Hospital F.Miulli), and 83 hypertensive controls (Bari University) (Ethic Committee, n°6903). MTHFR-C677T genotypes (qRT-PCR), AFib (bipolar peak-to-peak voltage), RBC, RDW and homocysteinemia were measured. Adhesion molecules and pro-inflammatory cytokine levels were measured on peripheral blood plasma. EPCs were isolated and functional in vitro (wound healing), and in vivo (Chick Chorioallantoic Membrane) assays were performed. Results: Baseline characteristics were similar in AF and controls. The percentage of AFib differs between MTHFR-C677T homozygous (n=15) vs MTHFR non-C677T homozygous (n=44) patients (P<0.01). The multivariate analysis shows RBC and RDW alteration and homocysteine increase in patients with MTHFR-C677T homozygosity (vs non-homozygous, P<0.005). Pro-inflammatory cytokines as well as adhesion molecules levels showed an increased in MTHFR-C677T homozygous patients (vs MTHFR non-C677T homozygous ones). The in vitro EPCs migration and the in vivo angiogenesis ability were impaired in MTHFR-C677T homozygous AF patients (vs non-homozygous, P< 0.05). The treatment with MTX in controls suggests the same results obtained in MTHFR-C677T homozygous patients in vitro and in vivo. Conclusions: The study findings suggest promising new perspectives for understanding the pathogenesis of ESUS, with significant implications for potential new risk stratification and primary prevention strategies.

“Ricerca e Validazione di Biomarcatori per la Identificazione Preventiva ed il Monitoraggio del Trattamento Farmacologico in soggetti ad alto rischio di Stroke Criptogenico” Background e Obiettivi: Il progetto di tesi pone l'ipotesi che dismetabolismi del ciclo dei folati, derivanti dalla mutazione MTHFR C6771, possano rappresentare un fattore ancora non identificato nella patogenesi dello stroke embolico da causa indeterminata (ESUS). Dalle indagini condotte è stato possibile evidenziare come tale mutazione si associ ad un aumentato grado di disfunzione endoteliale e fibrosi atriale, determinanti centrali della recentemente postulata "cardiomiopatia atriale". Quest'ultima entità anatomo-elettrofisiologica costituirebbe il substrato comune all'ESUS e ad alcune delle condizioni finora considerate possibili cause dello stesso, in primis la fibrillazione atriale (FA). Secondariamente, è stato evidenziato come il metotrexato (MTX), chemioterapico e immunosoppressore largamente impiegato nella pratica clinica, determini su linee stabilizzate di cellule endoteliali e su progenitori endoteliali circolanti (EPCs) di pazienti controllo le stesse alterazioni fenotipiche osservate nelle EPCs di pazienti portatori della mutazione MTHFR C677T. Metodi: Sono stati reclutati 59 pazienti con FA (Ospedale Generale F. Miulli) e 83 controlli ipertesi (Università di Bari) (Comitato Etico, n°6903). Sono stati misurati i genotipi MTHFR-C677T (qRT-PCR), fibrosi atriale (tensione picco-picco bipolare), i globuli rossi, l'RDW e l'omocisteinemia. Sono stati misurati i livelli di molecole di adesione e citochine proinfiammatorie sul plasma sanguigno periferico. Le EPC sono state isolate e funzionali in vitro (guarigione delle ferite) e sono stati eseguiti test in vivo (membrana corioallantoidea di Chick). Risultati: : Le caratteristiche basali erano simili in FA e controlli. La percentuale di FA differisce tra pazienti MTHFR-C677T omozigoti (n=15) vs MTHFR non-C677T omozigoti (n=44) (P<0,01). L'analisi multivariata mostra alterazione di RBC e RDW e aumento di omocisteina nei pazienti con omozigosi MTHFR-C677T (vs non omozigoti, P<0,005). Le citochine pro-infiammatorie così come i livelli di molecole di adesione hanno mostrato un aumento nei pazienti MTHFR-C677T omozigoti (vs MTHFR nonC677T omozigoti). La migrazione in vitro delle EPC e la capacità di angiogenesi in vivo sono state compromesse nei pazienti MTHFR-C677T omozigoti AF (vs non omozigoti, P<0,05). Il trattamento con MTX nei controlli suggerisce gli stessi risultati ottenuti nei pazienti omozigoti MTHFR-C677T in vitro e in vivo. Conclusioni: I risultati dello studio suggeriscono promettenti nuove prospettive nell’inquadramento patogenetico dell'ESUS, con importanti risvolti su possibili nuove strategie di stratificazione del rischio e prevenzione primaria.