Microbial degradation of polyester plastics: functional and metagenomic-based approaches for enzyme discovery

Plastics represent essential materials in our society, widely used in every industrial sector, thanks to their versatility, moldability, durability, lightweight, and low production cost. In less than a century, their production has increased to the point that they now represent the third most manufactured good, with an annual output exceeding 400 Mt. However, inadequate plastic waste management practices have led to ecosystemic plastic pollution. Plastic waste degrades slowly into hazardous microplastics, and by absorbing environmental pollutants and entering the trophic chain, they pose a serious threat to animals and human health. Therefore, the current linear plastic production model must transition to a circular approach. In this context, biocatalysis has emerged as a promising recycling strategy for polyester polymers, including polyethylene terephthalate (PET), polylactic acid (PLA), and polyhydroxybutyrate (PHB). This work focused on characterising the polyester-degrading potential of microorganisms sourced from a wastewater treatment plant (WWTP), to identify novel polyester-active biocatalysts. Additionally, it explored synergistic interaction between commercial enzymes for PLA depolymerisation. Five microbial consortia were enriched under mesophilic and mildly thermophilic conditions in a low-carbon environment supplemented with a high concentration of polyester polymers, including post-consumer PET, post-consumer PLA, or virgin PLA. Over 100 days of enrichment, the PLA polymers were effectively depolymerised by these microbiomes, as confirmed by gel permeation chromatography and nuclear magnetic resonance analyses. A combined in vivo functional screening and in silico homology-based search were carried out to identify the hydrolytic enzymes responsible for PLA degradation. Among 148 isolates exhibiting secretion of esterase activity, three were able to degrade aliphatic polyesters such as polycaprolactone (PCL) and PHB in vivo. The three isolates were identified as two distinct strains belonging to the Bacillus genus based on 16S rRNA sequencing and poly(GTG)5-associated profiles. Moreover, phylogenetic analysis of the metagenomes revealed that temperature significantly influenced microbiome composition, with Bacillales dominating at higher temperatures, while a more diverse community emerged at 37°C, shaped by the kind of plastic polymer used for the selection. A homology-based sequence search using Hidden Markov Models (HMM) identified 10 potential extracellular PLA depolymerases with high statistical confidence, belonging to the lipase and endopeptidase enzymatic families. Moreover, it identified a novel putative extracellular PHA depolymerase (PhaZCf) which was heterologously expressed and biochemically characterised. PhaZCf exhibited PHB depolymerisation under mesophilic conditions and mildly acidic pH, demonstrating remarkable thermo-stability. Kinetic parameters were investigated both in a conventional and inverse Michaelis-Menten (M-M) approach, showing that the conventional M-M approach provides wider applicability to study the kinetics of enzymes belonging to this protein family. Finally, PLA degradation was investigated using commercial enzymes, demonstrating the synergistic effects exerted by hydrolytic and oxidoreductase enzymes on Proteinase K-mediated PLA depolymerisation. The syn-ergistic effects were demonstrated to be mediated by an increase in productive binding of Proteinase K to the substrate.

Nella società odierna la plastica rappresenta un materiale essenziale, ampiamente utilizzato per le sue caratteristiche di versatilità, modellabilità, resistenza, leggerezza ed economicità. In meno di un secolo la produzione di plastica è aumentata al punto da diventare il terzo bene di consumo più fabbricato al mondo, con una produzione annua che supera le 400 Mt. La maggior parte della plastica prodotta viene impiegata per la realizzazione di oggetti di breve durata di utilizzo (usa e getta). A causa dell’inadeguata gestione dei rifiuti plastici si è giunti ad un inquinamento diffuso in tutti gli ecosistemi. Nell’ambiente, tali rifiuti si degradano lentamente in microplastiche, che sono in grado di assorbire inquinanti ambientali e che, grazie alla loro capacità di entrare nella catena trofica, rappresentano una grave minaccia per la salute animale e umana. Per affrontare ciò, l'attuale modello lineare di produzione della plastica deve evolversi verso un approccio di circolarità: recentemente, la biocatalisi è emersa come una strategia promettente per il riciclo di materiali plastici, tra cui il polietilene tereftalato (PET), l'acido polilattico (PLA) e il poliidrossibutirrato (PHB). Questo studio si è concentrato sulla caratterizzazione di microrganismi isolati da un impianto di trattamento delle acque reflue, al fine di identificare nuovi enzimi per la degradazione dei poliesteri sopracitati. Inoltre, è stata analizzata l'interazione sinergica tra enzimi commerciali per la depolimerizzazione del PLA. Cinque consorzi microbici sono stati arricchiti in condizioni mesofile e moderatamente termofile in presenza di elevate concentrazioni di poliesteri, tra cui PET post-consumo, PLA post-consumo e PLA vergine. Durante i 100 giorni di arricchimento, il PLA è stato efficacemente depolimerizzato dai consorzi microbici, come confermato dalle analisi di cromatografia ad esclusione molecolare e risonanza magnetica nucleare. Per identificare gli enzimi idrolitici responsabili della degradazione del PLA, è stato utilizzato un approccio duale: in vivo ed in silico. Inizialmente, i consorzi microbici sono stati sottoposti ad uno screening funzionale: 148 isolati hanno mostrato attività esterasica secreta, tre di essi hanno dimostrato la capacità di degradare (in vivo) poliesteri alifatici come il policaprolattone e il PHB. Grazie al sequenziamento dell’rRNA 16S e alla tipizzazione molecolare, i tre isolati sono risultati due ceppi distinti appartenenti al genere Bacillus. Inoltre, l'analisi filogenetica dei metagenomi ha rivelato che la composizione microbica dei consorzi è stata significativamente influenzata dalla temperatura. Infatti, a temperature più elevate sono stati arricchiti microorganismi appartenenti all’ordine dei Bacillales. A 37°C, invece, sono state arricchite comunità microbiche più diversificate, la cui composizione è stata influenzata dal polimero plastico. Tramite ricerca per omologia, sfruttando i modelli Markoviani nascosti, 10 potenziali PLA depolimerasi, appartenenti alle famiglie enzimatiche delle lipasi e delle endopeptidasi, sono state identificate con elevata confidenza statistica. Inoltre, è stata identificata una nuova PHA depolimerasi extracellulare (PhaZCf) che, a seguito dell’espressione eterologa, è stata caratterizzata biochimicamente. PhaZCf ha mostrato attività di depolimerizzazione del PHB in condi-zioni mesofile e a valori di pH debolmente acidi, dimostrando una notevole termostabilità. I parametri cinetici sono stati analizzati utilizzando sia l'approccio convenzionale che l'approccio inverso di Michaelis-Menten (M-M), evidenziando che il modello M-M convenzionale offre una maggiore applicabilità per enzimi appartenenti a questa famiglia proteica. Infine, la degradazione del PLA è stata analizzata mediante l'uso di enzimi commerciali, dimostrando che enzimi idrolitici e redox esercitano un effetto sinergico sulla depolimerizzazione del PLA mediata dalla Proteinasi K. Gli effetti sinergici sono stati dimostrati essere mediati da un aumento del legame produttivo della Proteinasi K sul substrato.