Approcci molecolari innovativi per la diagnosi di Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa (Xf) is a phytopathogenic bacterium with a wide host range and several xylem-sap feeding insects responsible for its spread. When favourable epidemiological conditions occur, the bacterium may cause detrimental diseases in several plant species, leading to significant economic losses, as no effective control measures are yet available. Nowadays, it is listed among the priority quarantine pest for the European Union, implying that mandatory surveillance programs are enforced in all Member States, to prevent the introduction and the further spread of the bacterium in Xf-free areas, as well as the rapid detection of new outbreaks. In Europe, strains harboring different genotypes/sequence types, belonging to different subspecies have been reported in several countries infecting lots of species of agricultural, forest and ornamental interest and causing severe to mild or latent infections. The Olive Quick Decline Syndrome, first described in 2013 in the Apulia region on symptomatic olive trees and caused by isolates belonging to the subspecies pauca strain ST53, is perhaps the most emblematic case of the destructive threat posed by this pathogen. The timely identification of new outbreaks or new infections in the infected areas is crucial because it allows for removing and/or contributing to reduce the inoculum reservoir. Therefore, it is important to have diagnostic techniques with high sensitivity, specificity and high throughput protocols able to provide rapid diagnostic responses and allow for large-scale testing. To accomplish this goal, the PhD program focused on developing new diagnostic protocols for Xf diagnosis with three main objectives: a) technological innovation of the molecular diagnostics currently available; b) development of “lab-free” approaches for on-site detection; c) development of specific protocols for the detection in infected hosts of viable/actively multiplying bacterial cells. Regarding the first objective, the optimization of a ddPCR assay significantly improved the diagnostic sensitivity and the absolute quantification of the pathogen’s genomic DNA in five plant and insect matrices, enabling to assess the status of samples testing “doubtful” by conventional qPCR assay, which is currently considered the reference technique for the detection of the bacterium. Secondly, two LAMP and RPA protocols were developed. These isothermal amplification assays offer portable and low-cost solutions for the pathogen’s identification directly in the field, without requiring purified nucleic acid or sophisticated devices, and skilled personnel. Finally, based on the dual-RNA sequencing data, a bacterial transcript with the highest gene expression level was identified in an olive tree with a systemic infection. The gene encoding for this transcript was then used as target for a new reverse transcriptase qPCR protocol, able to determine the multiplication rate of the bacterial cells in the xylem vessels of susceptible and resistant plant species to Xf infections. This diagnostic approach has remarkable potential applications given that the bacterium is difficult to grow in artificial media and thus estimate the colony-forming units associated with an infected host plant. The panel of diagnostic approaches implemented in the PhD program allows to fulfil several needs of the surveillance programs ongoing for this harmful pathogen: high sensitivity, suitability to be used directly in the field, cost-effective for large scale screening tests (i.e., in nurseries and on consignments) and capability to differentiate host plants supporting active bacterial multiplication (i.e., source of inoculum for insect vectors) from host plants harbouring dead bacterial cell populations.

Xylella fastidiosa (Xf) è un batterio fitopatogeno con un’ampia gamma di piante ospiti e insetti vettori in grado di diffonderlo, che causa gravi malattie determinando significative perdite economiche, anche per la mancanza di mezzi di lotta efficaci. Attualmente, è annoverato tra gli organismi nocivi prioritari da quarantena rilevanti per l’UE, per cui sono obbligatori programmi di sorveglianza fitosanitaria in tutti gli Stati Membri, finalizzati a prevenirne l’introduzione in territori indenni e a intercettare eventuali nuovi focolai. In Europa, la presenza di varie sottospecie e ceppi del batterio è stata segnalata in diversi Paesi e su diverse specie di interesse agrario, forestale ed ornamentale, causando infezioni più o meno gravi o paucisintomatiche. Tra le prime, l’epidemia del deperimento rapido dell’olivo in Puglia, iniziata nel 2013 con l’identificazione di ceppi di Xf subsp. pauca genotipo ST53 in olivi sintomatici, rappresenta il caso più emblematico del potere distruttivo di questo patogeno. Un punto cardine delle misure di eradicazione e/o di contenimento è l’identificazione delle piante infette al fine di attuare strategie volte ad eliminare e/o ridurre il serbatoio di inoculo. È quindi fondamentale disporre di tecniche diagnostiche con elevata sensibilità, specificità e ad alta processività, in grado di fornire esiti in tempi brevi e da applicare per diagnosi massale su larga scala. Per rispondere a queste esigenze, il programma di dottorato ha avuto come focus principale lo sviluppo di nuovi protocolli diagnostici per il rilevamento del batterio con tre finalità: a) innovazione tecnologica delle tecniche diagnostiche molecolari; b) sviluppo di approcci “instruments-free” per la diagnosi on site; c) sviluppo di protocolli diagnostici per il rilevamento specifico delle cellule batteriche in attiva moltiplicazione rispetto a quelle non vitali o inattive. Con riferimento al primo obiettivo, l’ottimizzazione di un protocollo di ddPCR, ha migliorato la sensibilità diagnostica e le metodiche di quantificazione assoluta del DNA del patogeno in cinque matrici vegetali ed insetti vettori, riuscendo a definire lo stato sanitario di campioni “non determinabili” al saggio qPCR, ad oggi considerata la tecnica di riferimento per il rilevamento del batterio. Relativamente al secondo obiettivo, sono stati sviluppati due protocolli di LAMP e RPA, tecniche di amplificazione isotermica che offrono soluzioni portatili per il rilevamento del patogeno direttamente in campo, senza la necessità di adoperare acidi nucleici purificati e strumentazione sofisticata, il cui utilizzo è non solo dispendioso in termini di tempo e costi, ma richiede anche personale qualificato. Infine, riguardo al terzo obiettivo, sulla base dei dati di sequenziamento dual-RNA seq è stato identificato, in olivo con infezione sistemica, il trascritto del batterio con più elevato livello di espressione genica. Il corrispondente gene è stato quindi impiegato come target in un nuovo protocollo di RT-qPCR mirato a rilevare il livello di attività replicativa e di crescita delle cellule batteriche nei vasi xilematici di specie vegetali suscettibili e resistenti alle infezioni. Quest’ultimo approccio ha elevate potenzialità applicative in virtù della scarsa propensione del batterio alla crescita in coltura e alle difficoltà di isolamento e conta delle unità formanti colonie. L'integrazione di queste tecniche innovative nella sorveglianza fitosanitaria può migliorare significativamente la capacità di diagnosi precoce e su larga scala in relazione non solo alla necessità di monitorare vasti territori e un numero elevato di specie ospiti, ma anche di disporre di tecniche economicamente sostenibili per i controlli da effettuarsi in vivaio prima della movimentazione delle produzioni vivaistiche di alcune specie particolarmente suscettibili come definito dalla normativa vigente.