Contributo di alterazioni metaboliche alla morte cellulare dei fotorecettori durante degenerazione retinica

Retinitis Pigmentosa (RP) is a group of hereditary diseases causing photoreceptors degeneration and blindness. RP shows an extensive genetic heterogeneity, although common molecular events like oxidative stress, inflammation and metabolic dysfunction are known contributors to disease progression. Nevertheless, the precise roles of these factors remain poorly understood. This project aims to characterize the contribute of metabolism-related alterations to photoreceptor cell death during retinal degeneration in order to identify potential novel therapeutic approaches for RP. We started our study with a gene expression analysis on the cellular model 661W-A11 treated with Zaprinast, a phosphodiesterase 6 (PDE6) inhibitor, to induce rod degeneration. This analysis highlighted significant dysregulation of genes related to cholesterol biosynthesis and aerobic glycolysis, including the downregulation of Srebf2, the main activator of cholesterol synthesis, and Hk2, which encodes the key enzyme for aerobic glycolysis. These data hinted at an overall disruption of cellular metabolic homeostasis in the in vitro system. To validate the importance of these identified pathways in retinal degeneration, changes in expression of selected candidate genes were assessed in in vivo models for photoreceptor degeneration using Real-time qPCR analysis. In alignment with the in vitro model, cholesterol and glycolysis-related genes were as well dysregulated in RNA extracted from total retinas of RP mice. Additional analysis of rod-enriched fractions confirmed that the gene dysregulation was occurring in photoreceptors. Moreover, altered expression of cholesterol-related genes was found also in human iPSC-derived organoid models of photoreceptors degeneration, indicating that the findings in murine retinas may have relevance to the human pathology. Besides, altered nuclear localization SREBP2 and changes in cholesterol metabolites were detected in 661W-A11cells after Zaprinast treatment as well as in other analyzed models, further supporting a disrupted cholesterol homeostasis. Taken together, these data suggest that alterations in cellular metabolic homeostasis may be common event in retinal degeneration and could help in developing new biomarkers or new treatments. Along with the identification of a new therapeutic target, development of a robust delivery system is essential for a successful treatment. To this aim, I have been analyzing some drug delivery strategies based on either adeno-associate viruses (AAVs) or lipid nanoparticles (LNPs). In conclusion, this work suggests that during retinal degeneration, photoreceptors experience abnormal cholesterol synthesis and aerobic glycolysis. These alterations may lead to critical metabolic dysfunctions that are crucial for rod survival. Further elucidations of the contribution of dysregulated metabolic processes to photoreceptor cell death might help the identification of novel biomarkers and mutation-independent neuroprotective strategies.

La Retinite Pigmentosa (RP) è un gruppo di malattie ereditarie che causano degenerazione dei fotorecettori e cecità. La RP è geneticamente molto eterogenea, sebbene sia noto che eventi molecolari comuni come stress ossidativo, infiammazione e disfunzioni metaboliche contribuiscano alla progressione della malattia. Ciononostante, il ruolo preciso di questi fattori rimane ad oggi poco compreso. Questo progetto ho lo scopo di chiarire il contributo di pathway metaboliche alterate alla morte dei fotorecettori durante la degenerazione retinica al fine di identificare potenziali nuovi approcci terapeutici per la RP. In primo luogo, abbiamo condotto un'analisi dell'espressione genica sul modello cellulare 661W-A11 trattato con Zaprinast, un inibitore della fosfodiesterasi 6 (PDE6), per simulare la degenerazione dei bastoncelli. Questa analisi ha evidenziato una significativa disregolazione di geni coinvolti nella biosintesi del colesterolo e nella glicolisi aerobica, tra cui la downregulazione di Srebf2, il principale attivatore della sintesi del colesterolo, e di Hk2, gene codificante l'enzima chiave per la glicolisi aerobica. Tali dati hanno suggerito una complessiva distruzione dell'omeostasi metabolica cellulare nel sistema in vitro. Per validare la rilevanza delle pathway identificate per la degenerazione retinica, cambiamenti nell'espressione di geni candidati sono stati successivamente valutati in ulteriori modelli rilevanti per la degenerazione dei fotorecettori tramite analisi qPCR in tempo reale. In linea con il modello in vitro, geni correlati al colesterolo e alla glicolisi erano disregolati anche nelle retine totali di topi RP. Ulteriori analisi delle frazioni arricchite di bastoncelli hanno confermato che la disregolazione genica si stava verificando nei fotorecettori. Inoltre, è stata riscontrata un'espressione alterata di geni correlati al colesterolo anche in modelli di degenerazione dei fotorecettori basati su organoidi retinici derivati da iPSC umane, indicando che i risultati ottenuti nelle retine murine potrebbero avere rilevanza per la patologia umana. In aggiunta, sono stati osservati cambiamenti nella localizzazione nucleare di SREBP2 e varizioni legate ai metaboliti del colesterolo nelle cellule 661W-A11 dopo il trattamento con Zaprinast, così come in altri modelli analizzati, supportando ulteriormente l’idea di una distruzione dell'omeostasi del colesterolo. Complessivamente, questi dati suggeriscono che alterazioni nell'omeostasi metabolica cellulare potrebbero rappresentare un evento comune durante la degenerazione retinica e potrebbero servire da bersaglio per nuovi biomarcatori o nuovi trattamenti. Affinchè un trattamento abbia successo, oltre all'identificazione di un target terapeutico efficace, è essenziale anche sviluppare un sistema di somministrazione robusto. Pertanto, sono state infine valutate alcune strategie di somministrazione di farmaci basate su Virus Adeno-Associati (AAV) o nanoparticelle lipidiche (LNP). In conclusione, questo lavoro suggerisce che durante la degenerazione retinica i fotorecettori subiscono un'anormale sintesi di colesterolo e di glicolisi aerobica. Queste alterazioni possono portare poi a disfunzioni metaboliche critiche che sono cruciali per la sopravvivenza dei bastoncelli. Ulteriori chiarimenti sul contributo dei processi metabolici disregolati alla morte dei fotorecettori potrebbero aiutare l'identificazione di importanti nuovi biomarcatori e strategie neuroprotettive per la RP che sono indipendenti dalla mutazione causante.