Correzione mediata da CRISPR di mutazioni che causano laminopatie nelle cellule di pazienti per identificare biomarcatori della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss e svelare le vie patogeniche nella Hutchinson-Gilford Progeria

Laminopathies are human rare disorders caused by several mutations in lamins and lamins-associated proteins. There are over 400 mutations resulting in multiple diseases and 11 distinct phenotypes can be defined within the laminopathy group. We are investigating type 1 Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD1); Mandibular hypoplasia, Deafness and Progeroid features with concomitant Lipodystrophy (MDPL); Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS). EDMD1 is a rare genetic X-linked disease caused by mutations in EMD gene encoding emerin protein. EDMD1 is characterized by the absence of emerin, thus nuclear lamina defects. To date, a cure for these pathologies is not available and the identification of biomarkers for the evaluation of disease progression is mandatory. To accomplish this aim, the generation of isogenic cells comparable to patients’ cells is required. Thereby, we genetically correct fibroblasts and myoblasts derived from two patients. The first patient (pt1) carries a point mutation in the exon 1 of EMD gene, which abolishes the start codon, thus the expression of emerin. The second patient (pt2) carries a 5-nt duplication in the exon 6 of EMD gene leading to a frameshift and generating a truncated emerin protein missing the transmembrane domain. The cytosine base editing system, packaged in a single lentiviral vector, was exploited to correct the exon 1 in pt1’s cells. The CRISPR/Cas9 nuclease, combined to a couple of gRNAs, was used to re-establish the frame, shifted by the duplication in exon 6, in cells derived from pt2. The HGPS disorder is caused by mutations in the exon 11 of the LMNA gene, which cause the production and accumulation of an abnormal truncated lamin A isoform, called progerin. Progerin triggers ageing-associated symptoms like postnatal growth retardation, lack of subcutaneous fat, low body weight, join contractures, hair loss and progressive cardiovascular disease. Many of these symptoms are in common to MDPL caused by de novo mutations in POLD1 gene encoding the p125 subunit of DNA polymerase delta (Polδ). Polδ is involved in DNA replication and repairs DNA in case of exposure to mutagens. Also lamin A plays a role in DNA replication and recruits DNA damage response factors. The impairment of these processes were observed in HGPS and MDPL. Lipodystrophy is still unresolved issue and an untreatable phenotype shared by progeroid syndromes including progeroid laminopathies and MDPL. Thereby, we generate in vitro models to unravel the LMNA-POLD1 interplay that leads to adipose tissue degeneration, and to identify new therapeutic targets for premature ageing diseases and ageing-related adipose tissue deterioration. To generate cells isogenic to skin fibroblasts from a Progeria patient, we exploited the SpRY-HF1-ABE8e system which reverts the base transition in the exon 11 of the LMNA gene. To eliminate the heterozygous de novo in frame deletion in the exon 15 of POLD1 allele, MDPL patient’s fibroblasts were treated with a mutation-specific gRNA combined to the SpCas9. In conclusion, CRISPR-corrected cells from EDMD1 patients were instrumental to identify miRNA profiles and profibrotic markers associated with the disease. CRISPR-corrected HGPS and MDPL patients’ cells represent isogenic control to provide new knowledge on the impaired interplay between lamin A/C and Polδ in stress response, which might be related to lipodystrophy.

Le laminopatie sono disturbi umani rari causati da diverse mutazioni nelle lamine e nelle proteine associate alle lamine. Esistono oltre 400 mutazioni che causano diverse malattie e all'interno del gruppo delle laminopatie si possono definire 11 fenotipi distinti. Noi stiamo studiando la distrofia muscolare Emery-Dreifuss di tipo 1(EDMD1); Mandibular hypoplasia, Deafness and Progeroid features with concomitant Lipodystrophy(MDPL); la sindrome Hutchinson-Gilford Progeria(HGPS). EDMD1 è una malattia genetica rara legata all’X causata da mutazioni nel gene EMD codificante la proteina emerina. EDMD1 è caratterizzata dall'assenza di emerina, quindi da difetti della lamina nucleare. Ad oggi, non è disponibile una cura per queste patologie e l'identificazione di biomarcatori per la valutazione della progressione della malattia è obbligatoria. Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria la generazione di cellule isogeniche paragonabili a quelle dei pazienti. Per questo motivo, abbiamo corretto geneticamente fibroblasti e mioblasti derivati da due pazienti. Il primo paziente(pt1) è portatore di una mutazione puntiforme nell'esone-1 del gene EMD, che abolisce il codone di inizio e quindi l'espressione di emerina. Il secondo paziente(pt2) è portatore di una duplicazione di 5-nt nell'esone-6 del gene EMD che porta a un frameshift e genera una proteina emerina tronca mancante del dominio transmembrana. Il sistema cytosine base editing, impacchettato in un singolo vettore lentivirale, è stato sfruttato per correggere l'esone-1 nelle cellule di pt1. La nucleasi CRISPR/Cas9, combinata con una coppia di gRNA, è stata utilizzata per ristabilire il frame, spostato dalla duplicazione nell'esone-6, nelle cellule di pt2. Il disturbo HGPS è causato da mutazioni nell'esone-11 del gene LMNA, che provocano la produzione e l'accumulo di un'isoforma anomala tronca di lamina A, chiamata progerina. Porgerina provoca sintomi associati all'invecchiamento, come ritardo di crescita postnatale, mancanza di grasso sottocutaneo, basso peso corporeo, contratture, perdita di capelli e progressiva malattia cardiovascolare. Molti di questi sintomi sono comuni alla MDPL causata da mutazioni de-novo nel gene POLD1 che codifica la subunità p125 della DNA polimerasi-delta(Polδ). Polδ è coinvolta nella replicazione del DNA e ripara il DNA in caso di esposizione a mutageni. Anche la lamina A svolge un ruolo nella replicazione del DNA e recluta i fattori di risposta al danno del DNA. L'alterazione di questi processi è stata osservata nella HGPS e MDPL. La lipodistrofia è un problema ancora irrisolto e un fenotipo incurabile condiviso dalle sindromi progeroidi, comprese le laminopatie progeroidi e MDPL. In questo modo, abbiamo generato modelli in-vitro per svelare l'interazione LMNA-POLD1 causante degenerazione del tessuto adiposo e per identificare nuovi bersagli terapeutici per le malattie da invecchiamento precoce e il deterioramento del tessuto adiposo legato all'invecchiamento. Per generare cellule isogeniche ai fibroblasti cutanei di un paziente affetto da Progeria, abbiamo sfruttato il sistema SpRY-HF1-ABE8e che reverte la transizione di base nell'esone-11 del gene LMNA. Per eliminare la delezione eterozigote de-novo in frame nell'esone-15 dell'allele POLD1, i fibroblasti di pazienti MDPL sono stati trattati con un gRNA specifico per la mutazione combinato con SpCas9. In conclusione, le cellule corrette con CRISPR di pazienti EDMD1 sono state utili per identificare profili di miRNA e marcatori profibrotici associati alla malattia. Le cellule corrette con CRISPR di pazienti HGPS e MDPL rappresentano un controllo isogenico per fornire nuove conoscenze sull'alterata interazione lamina A/C-Polδ nella risposta allo stress, che potrebbe essere correlata alla lipodistrofia.